细胞分离与培养技术.ppt

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1、临床药理研究所临床药理研究所1现代生物技术现代生物技术基因工程技术基因工程技术细胞工程技术细胞工程技术酶工程技术酶工程技术发酵工程技术发酵工程技术细胞培养细胞培养2细胞分离技术细胞分离技术l从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞l从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞l从原培养容器中分离细胞从原培养容器中分离细胞 -传代培养传代培养原代培养原代培养3细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞采血方法：采血方法：l人人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；l小动物（大鼠、小鼠）小动物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、剪尾法、眼

2、眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。断颈取血或股动脉放血。l兔兔 耳静脉或动脉穿刺取血。耳静脉或动脉穿刺取血。4细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞血液抗凝方法：血液抗凝方法：l肝素法肝素法：按每：按每mlml血液约用血液约用0.1-0.2mg0.1-0.2mg肝素（即肝素（即5%5%肝素溶液肝素溶液2-42-4l l）；）；l草酸盐法：草酸盐法：取草酸钾取草酸钾0.2g0.2g，草酸铵，草酸铵0.3g0.3g，加双蒸水，加双蒸水10ml10ml溶解后，取溶解后，取0.2ml0.2ml放入放入5ml5ml的试管中，使其干燥。若采用的试管中，使其干燥。若采

3、用5ml5ml以下的血液可直接注以下的血液可直接注入此试管中，轻轻摇晃；入此试管中，轻轻摇晃；l枸橼酸钠法：枸橼酸钠法：先配制先配制2%2%枸橼酸钠，取枸橼酸钠，取0.15-0.2ml0.15-0.2ml加于加于1ml1ml血液中即可血液中即可抗凝；抗凝；lEDTAEDTA法法（186.1186.1）：每）：每mlml血液中加血液中加0.5mmol/L EDTA 20.5mmol/L EDTA 2l l。5细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞体液标本采集：体液标本采集：在局部在局部70%70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿

4、刺入体腔（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。膝关节腔穿刺膝关节腔穿刺 胸腔穿刺胸腔穿刺 6细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞血样中红细胞和白细胞的分离：血样中红细胞和白细胞的分离：利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。抗凝血，室温或抗凝血，室温或3737下直立静置下直立静置30-60min30-60min，红细胞沉降至下层，中，红细胞沉降至下层，中

5、间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血与与3%3%明胶（经灭菌消毒）等量或明胶（经灭菌消毒）等量或3 3l l量混合于离心管中，直立静置量混合于离心管中，直立静置30-30-60min60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。7细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞血中单个核细胞的分离：血中单个核细胞的分离：单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.050-1.0771

6、050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。之间，采用速度沉降法原理使其分离。淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液8细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞血中单核细胞的分离：血中单核细胞的分离：利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离单单个个核核细细胞胞悬悬液液多将悬液放入多将悬液放入12cm12cm直径的培养皿直径的培养皿中，于中，于3737培养箱中静置培养箱中静置30-30-60min60min。此时单核细胞贴壁，而。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞

7、并用细胞，并用HanksHanks液轻轻冲洗培液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下养皿以尽量洗下未贴壁细胞（淋未贴壁细胞（淋巴细胞）。巴细胞）。用用Hanks液强液强力冲洗吹打与力冲洗吹打与震荡，将贴壁震荡，将贴壁的单核细胞冲的单核细胞冲落或用刮刀轻落或用刮刀轻刮，收集刮，收集贴壁贴壁的单核细胞的单核细胞。计数后计数后分别制分别制备所需备所需浓度的浓度的细胞悬细胞悬液。液。9细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞黏附法分离血中单核细胞、黏附法分离血中单核细胞、T T，B B淋巴细胞淋巴细胞 因因B B淋巴细胞和单核细胞能黏附于淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上（聚酰

8、胺纤维柱），尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与所以可将其与T T淋巴细胞分离。淋巴细胞分离。10具体步骤：具体步骤：l单个核细胞用含单个核细胞用含20%20%小牛血清小牛血清RPMI-1640RPMI-1640制成（制成（2.5-32.5-3）10107 7/ml/ml的细胞的细胞悬液。悬液。l先用先用HanksHanks液，再用含液，再用含20%20%小牛血清的小牛血清的RPMI-1640RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤维液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。柱，冲洗液尽量流净。l将尼龙柱预温将尼龙柱预温3737，再用配制的单个核细胞悬液，再用配制的单个核细胞悬液2ml2ml装入尼

9、龙纤维柱，装入尼龙纤维柱，不使流出，不使流出，3737温箱内静置温箱内静置l l小时。小时。l取下注射针头，用预温取下注射针头，用预温3737含含20%20%小牛血清的小牛血清的RPM I-1640RPM I-1640培养液冲洗培养液冲洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T T淋巴细胞。淋巴细胞。l从注射器内取出尼龙纤维，在从注射器内取出尼龙纤维，在44的的RPMI-1640RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤压，液内漂洗，并轻轻挤压，将黏附的将黏附的B B细胞洗脱收集（细胞洗脱收集（B B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离

10、其分离）。l收集的收集的T T、B B淋巴细胞可分别用淋巴细胞可分别用HanksHanks液悬浮，洗涤，离心（液悬浮，洗涤，离心（250g250g，7min7min），并重复洗涤），并重复洗涤3 3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的所需浓度的T T和和B B淋巴细胞悬液。淋巴细胞悬液。11细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞免疫磁珠法免疫磁珠法(MACS)(MACS)分离分离T T、B B淋巴细胞：淋巴细胞：磁性微珠是磁性微珠是2020世纪世纪8080年代初以高分子材料和金属离子（如年代初以高分子材料

11、和金属离子（如FeFe3 3O O4 4）为原料聚合而成的一种以为原料聚合而成的一种以金属离子为核心金属离子为核心、外层均匀地包裹、外层均匀地包裹高分子聚合高分子聚合体体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。即可制成免疫磁性微珠。12细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞免疫磁性微珠免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化用于

12、细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。分离的目的。通常有二种分离方式：通常有二种分离方式：阳性分离阳性分离和和阴性分离阴性分离。阳性分离是直接从细胞。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离

13、得以分离。13细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞、造血祖细胞(CD34)、单核、单核/巨噬细巨噬细胞胞(CD14)、胰岛细胞、胰岛细胞(胰岛胰岛GK和和GLUT2（葡萄糖转运子）（葡萄糖转运子）)、多种肿瘤、多种肿瘤细胞等。细胞等。14细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞15细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液

14、中分离细胞16细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞17细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞MACS技术优点技术优点：l稳定、高质量的分选稳定、高质量的分选：纯度（：纯度（90-99%）l对细胞无损伤对细胞无损伤l操作简便、快速：操作简便、快速：消毒方便，手动分选消毒方便，手动分选30分钟内分钟内完成，完成，autoMACS分选分选2.5-10分钟之内完成。分钟之内完成。l从实验室到临床：从实验室到临床：MACS技术可以实现技术可以实现105-1011个个细胞分选。有细胞分选。有autoMACS和和CliniMACS。l分选后细

15、胞适用于后续实验：分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。组分均可回收利用。l从细胞到分子分选：从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及及mRNA。MACS技术缺点：技术缺点：l分离效率较分离效率较流式细胞仪流式细胞仪分分选略低选略低l且耗材相对较贵，适合无且耗材相对较贵，适合无大型大型流式细胞仪流式细胞仪设备且对分设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。选细胞纯

16、度要求不高的分选。l只适用于简单标记的细胞只适用于简单标记的细胞分离分离18细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞流式细胞术分离法分离流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：淋巴细胞：l密度梯度离心法分离单个核细胞，用密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成培养基配成1107/ml；l加适量加适量FITC-抗抗CD3或或FITC-抗抗CD19，4孵育孵育30min,用用RPMI-1640培养基洗培养基洗2次；次；l用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿

17、色荧光阳性的细胞进行分选。参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。19细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞注意事项：注意事项：l分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。l此法分离得到的此法分离得到的T细胞纯度可达到细胞纯度可达到99%,收获率可达到收获率可达到90%。l由于喷嘴孔很小（约由于喷嘴孔很小（约70100m），分选前用），分选前用3040m孔径的滤网过孔径的滤网过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。滤细胞悬

18、液，以免堵塞喷嘴。20细胞分离技术细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞从血液、体液中分离细胞优缺点：优缺点：l流式细胞仪流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞，流式分选成本比磁珠低。流

19、式分选成本比磁珠低。l流式分选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技流式分选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。21细胞分离技术细胞分离技术二、从原代组织中分离细胞二、从原代组织中分离细胞组织和器官采集：组织和器官采集：l人标本：人标本：可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。l大量的动物组织：大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入先麻醉或处死，浸入70%70%酒精中，使毛皮全部

20、浸湿，从腹中酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹中线剪开皮肤，注意不要剪开胸腔或腹腔。将皮肤向上、下撕开分离并向上、下翻线剪开皮肤，注意不要剪开胸腔或腹腔。将皮肤向上、下撕开分离并向上、下翻开，暴露胸腹部的筋膜，用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛，以碘酒和开，暴露胸腹部的筋膜，用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛，以碘酒和70%70%酒精酒精消毒后，更换一套消毒灭菌的器械，剪开胸腔或腹腔，无菌采取所需器官。消毒后，更换一套消毒灭菌的器械，剪开胸腔或腹腔，无菌采取所需器官。l动物的骨髓：动物的骨髓：可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培养液从断

21、端一端加压注射以从另一断端出骨髓。养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓。22细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞制备细胞悬液方法：制备细胞悬液方法：l将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是是机械解离细胞法、酶学解离细胞法机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及以及螯合剂解离细胞螯合剂解离细胞法法。l从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚酶解聚。细胞。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。包暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。包括括胰蛋

22、白酶、胶原酶胰蛋白酶、胶原酶和和中性蛋白酶中性蛋白酶等。等。23细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞1.1.胰蛋白酶胰蛋白酶 (Trypsin)在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块，在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块，重复清洗重复清洗2到到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成1-2mm3小块。小块。将盛有组织碎片的容器置于冰上。加入将盛有组织碎片的容器置于冰上。加入0.25溶解在无钙镁的溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入组织加入1ml胰蛋白酶）。胰

23、蛋白酶）。24细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞在在4孵育孵育6到到18小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去去移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37孵育包含残留孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片胰蛋白酶的组织碎片20到到30分钟分钟在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂通过无菌不锈钢丝网（通过无菌不锈钢丝网（100-200目）过滤，计数和接种细胞，进行培目）过滤，

24、计数和接种细胞，进行培养养25细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞2.2.胶原酶胶原酶 (CollagenaseCollagenase)用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用小块，用Hanks平衡液平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次）清洗组织碎片几次加入胶原酶（加入胶原酶（50200单位单位/ml，溶解在，溶解在HBSS中）中）在在37孵育孵育4到到18小时。加入小时。加入3mMCaCl2增加解离效率增加解离效率26细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞通过离心在通过离心在HBSS中清洗悬液

25、几次中清洗悬液几次再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶27细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞3.3.中性蛋白酶中性蛋白酶(DispaseDispase)用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平衡小块，用不含钙镁的

26、平衡盐溶液清洗组织碎片几次盐溶液清洗组织碎片几次加入加入Dispase（0.62.4单位单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液）溶解在无钙镁的平衡盐溶液）在在37孵育孵育20分钟到几个小时。分钟到几个小时。28细胞分离技术细胞分离技术通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养再一次在培养基

27、中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养29细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞举例（滑膜细胞的胶原酶胰蛋白酶消化分离法举例（滑膜细胞的胶原酶胰蛋白酶消化分离法）:无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等用用D-Hanks液（无液（无Ca2+、Mg2+，含青霉素，含青霉素200kUL-1、链霉素、链霉素200mgL-1）反复冲洗后剪成）反复冲洗后剪成12mm3小块，离心洗涤小块，离心洗涤2次次置于加入置于加入2ml含含10%胎牛血清、胎牛血清、0.4%型胶原酶的型胶原酶的DMEM培养液的培培养液的培养瓶中，在养瓶中，在37、5%CO2培养箱中消

28、化培养箱中消化2h，每隔，每隔10min吹打吹打1次。次。30细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞再加入含再加入含0.25%胰蛋白酶的胰蛋白酶的D-Hanks液液4ml，培养消化，培养消化30min将培养液移至离心管中，将培养液移至离心管中，1200rpm离心离心10min，弃上清，弃上清200目尼龙网纱过滤，目尼龙网纱过滤，1200rpm离心离心10min，弃上清，弃上清将获得的细胞在将获得的细胞在37、5%CO2培养箱中培养培养箱中培养24h，弃去未黏附细胞，弃去未黏附细胞（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁细胞即为原代滑膜细胞（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁

29、细胞即为原代滑膜细胞31细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞4.4.组织块培养法组织块培养法举例（成纤维样滑膜细胞组织块培养法）：举例（成纤维样滑膜细胞组织块培养法）：无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用不含钙镁的无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用不含钙镁的D-Hanks液（含青液（含青霉素霉素200kUL-1、链霉素、链霉素200mgL-1）反复冲洗后剪成）反复冲洗后剪成12mm3小块小块用吸管吸取均匀排列于培养瓶（预先用含用吸管吸取均匀排列于培养瓶（预先用含20胎牛血清胎牛血清DMEM培养液湿培养液湿润）的底壁，瓶底朝上，润）的底壁，瓶底朝上，37、5%CO

30、2培养箱中培养培养箱中培养3h，使其贴壁，使其贴壁32细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞待细胞快长满时用待细胞快长满时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养，胰蛋白酶消化细胞并传代培养，取第取第35代细胞用于实验代细胞用于实验观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养轻轻翻转培养瓶，轻轻翻转培养瓶，使培养液刚刚覆盖组织块，每隔使培养液刚刚覆盖组织块，每隔23天换一次培养液天换一次培养液33成纤维样滑膜细胞组织块培养法成纤维样滑膜细胞组织块培养法培养培养24h培养培养96h培养培养120h34细胞分离技

31、术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞举例（初步淋巴细胞分离法）：举例（初步淋巴细胞分离法）：放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛有含有含5%小牛血清的小牛血清的D-Hanks液（不含钙镁，含青霉素液（不含钙镁，含青霉素200kUL-1、链、链霉素霉素200mgL-1）平皿的网纱中（）平皿的网纱中（200目）目）用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个细胞经网进入溶液中用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个细胞经网进入溶液中溶液移入离心管中，溶液移入离心管中，1200rpm离心离心10min

32、弃上清，弃上清，D-Hanks液洗涤液洗涤细胞，加入细胞，加入DMEM培养液计数和调节细胞浓度，进行培养培养液计数和调节细胞浓度，进行培养35细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）：举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）：基本原理基本原理：心肌细胞培养方法有心肌细胞培养方法有离体心脏灌注法离体心脏灌注法、酶消化法酶消化法和和组织块法组织块法，将心，将心肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结构与功能特性。下使之生长繁殖，并保留其结构与

33、功能特性。36细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞评价评价：l离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大;l酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但是酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但是能得到大量单细胞；能得到大量单细胞；l组织块法操作简单，实验成本低，可得到具较高纯度的心肌细胞。组织块法操作简单，实验成本低，可得到具较高纯度的心肌细胞。因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。37细胞分离技术细胞分离技术-从原代组

34、织中分离细胞从原代组织中分离细胞心肌细胞的酶消化培养法：心肌细胞的酶消化培养法：1.心肌组织的选择：心肌组织的选择：生后生后14天的天的Wistar乳鼠心脏等。乳鼠心脏等。2.心肌组织块的制备：心肌组织块的制备：乳鼠用乳鼠用75%乙醇乙醇/1%新洁尔灭消毒皮肤，新洁尔灭消毒皮肤，无菌开胸无菌开胸，暴露心脏暴露心脏，于心，于心脏收缩期剪下心脏，置于盛脏收缩期剪下心脏，置于盛D-Hanks液的培养皿中，剪开心脏，清洗三液的培养皿中，剪开心脏，清洗三次，以去除血污。次，以去除血污。38细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞3.心肌细胞悬液的制备：心肌细胞悬液的制备：取心尖

35、部组织（心室）剪为取心尖部组织（心室）剪为1mm3碎块，在大离心管中放入组织碎块，碎块，在大离心管中放入组织碎块，加入加入0.06%0.25%的胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶溶液815ml，在磁力搅拌器上，在磁力搅拌器上，37水浴水浴消化消化10min，自然沉淀后弃上清。剩余组织块中再加入新胰蛋白酶，自然沉淀后弃上清。剩余组织块中再加入新胰蛋白酶，消消化化10min，静置后将上清液移入盛有，静置后将上清液移入盛有15%新生牛血清培养液的离心管中终新生牛血清培养液的离心管中终止消化，并以止消化，并以1000rpm离心离心10min，弃上清，用培养液充分吹打成单细胞，弃上清，用培养液充分吹打成单细胞悬液。

36、剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化为止，分次收获心肌细胞。为止，分次收获心肌细胞。39细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞4.心肌细胞悬液的接种：心肌细胞悬液的接种：将分次收获的心肌细胞用将分次收获的心肌细胞用Hanks液离心清洗液离心清洗12次，弃上清液。将次，弃上清液。将沉淀细胞定量加入培养基沉淀细胞定量加入培养基35mL，吹打混匀，制成细胞悬液。应用白细，吹打混匀，制成细胞悬液。应用白细胞计数板计数细胞，调整至所需浓度，胞计数板计数细胞，调整至所需浓度，37、5%CO2培养箱

37、培养。培养箱培养。5.细胞纯化：细胞纯化：培养培养2h，将细胞悬液进行换瓶培养，去除瓶底的贴壁细胞；，将细胞悬液进行换瓶培养，去除瓶底的贴壁细胞；2h后，后，去除瓶底的贴壁细胞，重复一次，方法同前，以去除成纤维细胞，纯化去除瓶底的贴壁细胞，重复一次，方法同前，以去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。心肌细胞。40细胞分离技术细胞分离技术-从原代组织中分离细胞从原代组织中分离细胞心肌细胞的贴块培养法：心肌细胞的贴块培养法：1.取材：取材：按前述方法取出心脏，置于盛按前述方法取出心脏，置于盛Hanks液的培养皿中，清液的培养皿中，清洗三次。洗三次。2.贴块：贴块：将心脏剪为将心脏剪为1mm3大小的小块，移

38、入培养瓶底面，用无菌大小的小块，移入培养瓶底面，用无菌牙科探针将其均匀铺开。牙科探针将其均匀铺开。3.干固：干固：盖上瓶盖，盖上瓶盖，37烤箱培养瓶翻转干固烤箱培养瓶翻转干固11.5h。4.接种培养：接种培养：添加少量培养基，以恰好盖住组织块为佳，次日加添加少量培养基，以恰好盖住组织块为佳，次日加足培养液。足培养液。4142细胞分离技术细胞分离技术三、从原培养容器中分离细胞（传代培养）三、从原培养容器中分离细胞（传代培养）贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较足，培养基中的营养成份也消

39、耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。43细胞分离技术细胞分离技术-传代培养传代培养l对于贴壁不太紧的细胞如人胚胎肾（对于贴壁不太紧的细胞如人胚胎肾（HEK）293细胞等，可以直接吹细胞等，可以直接吹散后分瓶散后分瓶;l对于贴壁较紧的细胞如中华仓鼠卵巢（对于贴壁较紧的细胞如中华仓鼠卵巢（CHO）细胞、滑膜细胞）细胞、滑膜细胞（Synoviocytes）等，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均）等，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按无菌操作的要求进行）：按无菌操作的要求进行）：44细胞分离技术细胞分离技术-传代培

40、养传代培养将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去加入加入0.25胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使或更多，以使充分浸润充分浸润一般消化时间约为一般消化时间约为1-3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化，也可以在显微镜下观察细胞是否变圆，也可以在显微镜下观察细胞是否变圆视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例视实

41、验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例45细胞分离技术细胞分离技术-传代培养传代培养胰酶消化的程度是一个关键：胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。复吹打同样也会损伤细胞活性。46细胞分离技术细胞分离技术-传代培养传代培养影响消化速度的因素：影响消化速度的因素：主要有主要有胰酶溶液的活性胰酶溶液的活性（配制条件、（配制条件、冻存或冻存或4保存时保存时间长短、是否反复

42、冻融、化冻后存放时间及温间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加所加胰酶溶液的多少胰酶溶液的多少等。消化程度以轻吹或加培养液后轻摇可下等。消化程度以轻吹或加培养液后轻摇可下为好。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列为好。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考（以出以供参考（以CHO细胞为例）。细胞为例）。47复苏后细胞复苏后细胞培养培养24h培养培养48h刚加胰酶刚加胰酶开始皱缩开始皱缩明显皱缩明显皱缩基本变圆基本变圆完全变圆完全变圆48细胞培

43、养技术细胞培养技术l细胞培养的基本概念细胞培养的基本概念l体内、外细胞的差异和分化体内、外细胞的差异和分化l细胞培养的一般过程细胞培养的一般过程l细胞培养的无菌环境细胞培养的无菌环境l常用培养器皿及清洗消毒常用培养器皿及清洗消毒l培养物的污染及防止培养物的污染及防止l细胞培养常用营养液和试剂的配制细胞培养常用营养液和试剂的配制l细胞库细胞库49细胞培养技术细胞培养技术一、细胞培养的基本概念一、细胞培养的基本概念 体外培养体外培养（invitroculture），就是将活体结构成分或），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类

44、似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。境的体外环境中，让其生长和发育的方法。50细胞培养技术细胞培养技术-基本概念基本概念l组织培养组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。在体外进行培养的方法。l细胞培养细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。行培养的方法。l器官培养器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。、器官的一部分或器官原基在体外进行培

45、养的方法。51细胞培养技术细胞培养技术-体内、外细胞的差异和分化体内、外细胞的差异和分化二、体内、外细胞的差异和分化二、体内、外细胞的差异和分化差异：差异：细胞离体后，失去了细胞离体后，失去了神经体液的调节神经体液的调节和和细胞间的相互影响细胞间的相互影响，生活在，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：l分化现象减弱；分化现象减弱；l形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；l发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。发生转化获得不死性，变成可无限生长的连

46、续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。52细胞培养技术细胞培养技术分化：分化：体外培养的细胞体外培养的细胞分化能力分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化化的表现和在体内

47、不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分关键在于是否存在使细胞分化的条件，如化的条件，如FriendFriend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。行为。53细胞培养技术细胞培养技术三、细胞培养的一般过程三、细胞培养的一般过程 准备工作：准备工作：准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量

48、也较大，应给予足够的准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。内容包重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。内容包括括器皿的清洗、干燥与消毒、培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌、器皿的清洗、干燥与消毒、培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌、无菌室或超净台的清洁与消毒、培养箱及其他仪器的检查与调试无菌室或超净台的清洁与消毒、培养箱及其他仪器的检查与调试。54细胞培养技术细胞培养技术-细胞培养的一般过程细胞培养的一般过程 取材：取材：在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过在无菌环境下从机体取出

49、某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。细胞的首次培养称为原代培养。55细胞培养技术细胞培养技术-细胞培养的一般过程细胞培养的一般过程 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的体组织（尤其是

50、胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应取材后应立即处理，尽快培养立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置切成黄豆般大的小块，置44的培养液中保存。取组织时应严格的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。5