质粒DNA提取PPT课件.ppt
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1、小规模制备质粒小规模制备质粒DNADNA的技术分析的技术分析 一、一、实验目的实验目的(1)(1)学习小规模制备质粒学习小规模制备质粒DNADNA的技术的技术 。二、二、实验原理实验原理质粒质粒(Plasmid)(Plasmid):独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的遗传独立于染色体外的,能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链因子。是一种环状的双链DNADNA分子。分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中,在细菌细胞中最多。在细菌细胞中最多。细菌质粒细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类细菌质粒是用的最多的质粒类群,其大小从群
2、其大小从1Kb-200Kb,它们复它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。的同一组酶系。严谨型:严谨型:这些质粒的复制是在寄主细胞严格控这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的,与寄主细胞的复制偶联同步。所以,制之下的,与寄主细胞的复制偶联同步。所以,往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝;往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝;松驰型:松驰型:这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的,每个细胞中含有控制之下的,每个细胞中含有10-200份拷贝,份拷贝,如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成如果用一定的药物处理抑制寄主
3、蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒,要经过氯霉素处理即属于松弛型质粒,要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。才能达到更高拷贝数。质粒类型:质粒类型:载体载体(Vector)(Vector):用于携带重组用于携带重组DNADNA,并且能够使外源并且能够使外源DNADNA一起复制一起复制与表达的质粒与表达的质粒(运载工具运载工具)。具备的条件:具备的条件:易于鉴定;易于鉴定;在受体细胞中可以独立复制;在受体细胞中可以独立复制;易于筛选;易于筛选;易于导入受体细胞。易于导入受体细胞。1.1.抗性基因(抗性基因(Ant
4、ibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as gene,such as AmpicillinAmpicillin resistance gene,resistance gene,KanamycineKanamycine resistance gene)resistance gene)2.2.启始复制子(启始复制子(oriori,Origin of,Origin of replication)replication);3.3.多克隆位点多克隆位点(MSC,Multiple cloning(MSC,Multiple cloning si
5、te or site or polylinkerpolylinker);4.4.标记基因标记基因(Marker gene,such as(Marker gene,such as LacZLacZ gene)gene)。载体的结构:载体的结构:InsertEcoRIXhoI1.9kb三三.质粒提取的思路质粒提取的思路n质粒的特性:共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性:共价、闭合、环状的小分子量DNAn要去除的物质:要去除的物质:蛋白蛋白 基因组基因组DNA 脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质 RNA DNA DNA 是具有一定结构的物质,一些特殊的环是具有一定结构的物质,一些特殊的环境会导致境会导
6、致DNADNA的的变性,如加热、极端变性,如加热、极端pHpH值、值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等,而适宜的环有机溶剂、尿素、酰胺试剂等,而适宜的环境又可以使境又可以使DNADNA复性。复性。原理:原理:质粒DNA的提取方法n方法:碱裂解法;煮沸裂解;羟基磷灰石柱层析法,质粒DNA释放法;酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理n所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA,根据实验所需)n碱变性法提取碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在主要是利用共价闭合环状质粒
7、与线性染色质在拓扑学上的差异:拓扑学上的差异:n在在pH 12.0-12.6碱性环境碱性环境中,线性的大分子量细菌染色体中,线性的大分子量细菌染色体DNA变性,而共价闭环质粒变性,而共价闭环质粒DNA仍为自然状态;仍为自然状态;n将将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下,染色体调至中性并有高浓度盐存在的条件下,染色体DNA之之间交联形成不溶性网状结构,大部分间交联形成不溶性网状结构,大部分DNA和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态。通过离仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、R
8、NA及蛋白质,及蛋白质,质粒质粒DNA尚在上清中,尚在上清中,再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。n由于操作原因,提取的质粒可有三种结构:线形、开环、闭环超螺旋。由于操作原因,提取的质粒可有三种结构:线形、开环、闭环超螺旋。SDS是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性,所以SDS处理细菌细胞后,会导致细菌细胞壁的破裂,从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境,就会变性。然后,用酸性乙酸钾来中和溶液,使溶液处于中性,质粒DNA将迅速复性,而基因组DNA,由于分子巨大,难以复性。离心后,
9、质粒DNA将在上清中,而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。四、实验步骤四、实验步骤接含接含PUC18(PUC18(或或pET21a)pET21a)质粒的单菌落于质粒的单菌落于LB AmpLB Amp+液体培养基中液体培养基中37370 0C C,190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取取1.5菌液入菌液入1.5ml的的dorf管中管中10000rpm10000rpm、离心离心1min1min,弃上清,收集菌体弃上清,收集菌体100uL100uL溶液溶液I I悬浮菌体(悬浮菌体(轻轻混匀轻轻混匀),室温(或冰浴),室温(或冰浴
10、2min2min加入加入2 250uL50uL溶液溶液IIII(轻轻混匀轻轻混匀,反复反复4-6次次),室温静置),室温静置1min1min,裂解,裂解菌体菌体加入加入150uL150uL溶液溶液IIIIII(轻轻混匀轻轻混匀),室温静置),室温静置,冰上放置冰上放置5min5min,质粒,质粒DNADNA复性复性1 12000rpm2000rpm,离心离心1 15min5min,将上清转至另一离心管中备用将上清转至另一离心管中备用向上清中加入等体积氯仿向上清中加入等体积氯仿/异戊醇(异戊醇(24:1)(去蛋白),反复混匀,)(去蛋白),反复混匀,10000rpm,离心离心10min,将上清
11、转至另一离心管中备用将上清转至另一离心管中备用向上清加入向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置倍体积乙醇,混匀后,室温放置1520min12000r/min离心离心 10 min。倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。用用500 L 70%乙醇洗涤质粒乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。气中干燥。加入适量(加入适量(30 L)的)的TE其中含有其中含有20 ug/ml的的RNA酶,使酶,使DNA完全溶解完全溶解20保存。保存。原理示意图原理示意图相关原理n相关原理
12、解释溶液I的作用n控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液,是再自然不过的了。n葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。q如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。nEDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是:抑制DNase的活性,和抑制微生物生长。n如果不加EDTA,其实也没什么大不了的,只要不磨洋工,只要是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕DNA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。n如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽
13、提质粒呢?n实话告诉你,只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了。n有一点不能忘的是,菌体一定要悬浮均匀,不有一点不能忘的是,菌体一定要悬浮均匀,不能有能有结块。溶液IIn用新鲜新鲜的0.4N的NaOH和2的SDS等体积混合后使用的。n要用新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。nn破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提。q细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。溶液IIn为什么要加SDS呢?n那是为下一步操作做的铺垫。n这一步要记住两点:第一,时间不能过长,千万不要这时
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