分子生物学研究法PPT课件.ppt

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1、第六章第六章 分子生物学研究法（下）聚聚合合酶酶链链反反应应（Polymerasechainreaction，PCR）是是一一种种体体外外扩扩增增DNA片片段段的的方方法法，与与用用载载体体和和宿宿主主细细胞胞的的体体内内扩扩增增相相比比，有有简简便便、快快速的优点，并有许多特殊的用处。速的优点，并有许多特殊的用处。PCR的特点的特点一、一、PCR聚合酶链反应聚合酶链反应PCR的基本原理一PCR的基本原理二PCR的基的基本原理本原理PCR FlashPCR反应的体系1DNA模板模板2一对引物一对引物3耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶44dNTP5缓冲液缓冲液6Mg2+、K+离子离子7酶活性保护剂

2、酶活性保护剂PCR仪 PCR仪仪实实际际上上就就是是一一种种温温度度循循环环仪仪，它它能能够够快快速速地地升升降降温温和和保保持持恒恒温温，全全部部由由电电脑脑控控 制制。常常 用用 的的 反反 应应 容容 器器 有有 0.2ml的的 薄薄 壁壁Eppendorf管和毛细玻璃管。管和毛细玻璃管。对DNA模板的要求 对对DNA模模板板纯纯度度的的要要求求不不很很高高，但但必必须须除除去去DNA聚聚合合酶酶抑抑制制剂剂。理理论论上上有有一一个个DNA模模板板分分子子就就可可以以扩扩增增出出大大量量的的产产物物，实实际际上上使使用用pgng级级的的模模板板量量。模模板板一一般般是是双双链链分分子子，

3、也也可可以以是是单单链链分分子子。模模板板DNA分分子子不不宜宜太太长长，可可用用切切点点稀稀少少的的限限制制酶酶切切成成较较短短的的片片段段。由由于于环环状状DNA模模板板的的扩扩增增效效率率较较线线状状DNA模模板板低低，所所以以最最好好先先将将环环状状DNA用用限限制制酶酶切切成成线状再行扩增。线状再行扩增。RNA模板应先逆转录成模板应先逆转录成cDNA再进行再进行PCR扩增。扩增。引 物1长长度度一一般般为为1530个个核核苷苷酸酸。引引物物太太短短与与模模板板结结合合的的位位点点特特异异性性差差，引引物物太太长长与与模模板板结结合的速率下降，影响合的速率下降，影响PCR的效率。的效率

4、2不不应应有有超超过过3个个连连续续的的C或或G。引引物物自自身身不不存存在在互互补补序序列列，两两个个引引物物之之间间也也不不能能有有超超过过4个连续碱基互补的情况。个连续碱基互补的情况。3当当引引物物的的3端端有有足足够够长长与与模模板板互互补补的的序序列列时时，引引物物的的5端端可可以以不不与与模模板板互互补补，利利用用这这点点可可在在PCR产产物物的的两两端端加加上上特特殊殊序序列列（如如限限制制性性内切酶位点）。内切酶位点）。引物引物5端外加端外加BamH酶切酶切位点掺入产物的两端位点掺入产物的两端引 物4为为了了方方便便PCR产产物物的的检检测测和和分分析析，可可以以在在引引物物

5、的的5端端以以同同位位素素或或非非同同位位素素修修饰饰（32P、荧荧光素、生物素等）。光素、生物素等）。5当当要要扩扩增增的的DNA序序列列不不知知，但但知知其其编编码码的的氨氨基基酸酸序序列列，可可反反推推出出DNA序序列列，为为设设计计引引物物提提供供依依据据。因因简简并并密密码码的的存存在在，反反推推出出的的DNA序列是不唯一的，这时应采用简并引物。序列是不唯一的，这时应采用简并引物。引物引物 5 5 端修饰技术端修饰技术修饰法修饰法用途用途修饰法修饰法用途用途1.附加核酸序列附加核酸序列2.功能基因修饰功能基因修饰酶切位点酶切位点便于克隆等便于克隆等同位素同位素(35S,32P)检测，

6、定量检测，定量噬菌体启动子噬菌体启动子测序，合成测序，合成RNA探针等探针等生物素生物素检测，纯化，定量检测，纯化，定量蛋白质结合序列蛋白质结合序列产物纯化，检测产物纯化，检测荧光素荧光素检测，纯化检测，纯化酶酶检测检测Taq DNA聚合酶 现现在在常常用用的的Taq酶酶，在在95的的变变性性温温度度下下（20秒秒），经经过过50次次循循环环仍仍保保持持65%的的酶酶活活性性。对对于于Taq酶酶的的聚聚合合酶酶活活性性来来说说，最最佳佳作作用用温温度度为为7580，60时时聚聚合合酶酶活活性性仅仅剩剩1/2，37时时聚聚合合酶酶活活性性仅仅剩剩1/10。但但在在许许多多情情况况下下，需需要要在

7、在低低于于最最适适温温度度条条件件下下进进行行聚聚合合反反应应，以以免免引引物从模板上解离下来。物从模板上解离下来。Taq DNA聚合酶 Taq酶酶有有53的的聚聚合合活活性性和和53的的外外切切活活性性，但但缺缺少少35的的外外切切活活性性，所所以以没没有有校校正正功功能能，有有时时会会发发生生错错误误合合成成。使使用用Taq酶酶还还往往往往在在所所有有扩扩增增产产物物的的3端端增增加加一一个个非非模模板板依依赖赖的的A。现现在在作作为为商商品品供供应应的的Taq酶酶有有从从嗜嗜热热水水生生菌菌中中提提纯纯的的天天然然酶酶和和利用大肠杆菌生产的基因工程酶。利用大肠杆菌生产的基因工程酶。PCR

8、的反应体系 PCR中中常常用用的的缓缓冲冲液液是是1050 mmol/L的的Tris-HCl缓缓冲冲液液，pH8.38.9，还还需需要要合合适适的的Mg2+浓浓度度（约约1.5mmol/L）和和K+浓浓度度（50mmol/L），其其中中Mg2+浓浓度度须须经经过过预预备备实实验验确确定定合合适适的的值值，在在0.05 mmol/L和和5 mmol/L之之间间试试验验，按按每每0.5mmol/L增增加加。Mg2+浓浓度度太太高高时时非非特特异异扩扩增增增增加加，太低时产物减少。太低时产物减少。PCR的反应体系 Taq酶酶的的用用量量必必须须适适当当，一一般般典典型型的的扩扩增增反反应应加加2单单

9、位位的的酶酶，太太高高非非特特异异扩扩增增增增加加，太太低低时时扩扩增增效效率率下下降降。4种种dNTP的的浓浓度度应应相相等等，浓浓度度在在20200mol/L之之间间。反反应应体体系系中中加加入入BSA或或明明胶胶可可以以保保护护Taq酶酶活活性性。在在无无热热盖盖的的PCR仪仪上上，反反应应液液表表面应加矿物油以阻止蒸发。面应加矿物油以阻止蒸发。循环条件的设定变性变性-退火退火-链延伸链延伸循环循环变性变性退火退火链延伸链延伸首轮循环首轮循环945min502min723min中间循环中间循环941min502min723min末轮循环末轮循环941min502min7210min循环条

10、件举例循环条件举例 在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。退退火火温温度度较较低低可可提提高高扩扩增增效效率率，但但产产物物的的特特异异性性较较差差；退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。嵌套PCR(nestedPCR)嵌套嵌套PCR主要是为了提主要是为了提高扩增产物的特异性。高扩增产物的特异性。嵌套PCR提高产物特异性的原理单用第一对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。单用第一对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。单用第二对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异

11、性产物。单用第二对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。以第一对引物扩增的产物为模板，用第二对引物再次扩增，只得到特以第一对引物扩增的产物为模板，用第二对引物再次扩增，只得到特异性产物。异性产物。特异性产物特异性产物特异性产物特异性产物非特异性产物非特异性产物非特异性产物非特异性产物反向PCR(invertedPCR)反向反向PCR扩增已知序扩增已知序列两侧的未知序列。列两侧的未知序列。锚式PCR(anchoredPCR)锚式锚式PCR扩增已知扩增已知序列一侧的序列。序列一侧的序列。锚式PCR扩增已知序列3侧序列扩扩增增mRNA3端端或或5端端的序列称为的序列称为RACE。Rapi

12、d Amplification of cDNA Ends锚式PCR扩增已知序列5侧序列扩增全长的mRNA序列 要要扩扩增增全全长长的的mRNA，先先用用oligo(dT)作作引引物物逆逆转转录录该该mRNA成成全全长长的的cDNA第第一一链链，再再给给cDNA第第一一链链的的3端端进进行行同同聚聚物物加加尾尾（如如 GGGGG），最最 后后 用用 oligo(dT)和和oligo(dC)进行扩增。进行扩增。不对称PCR(asymmetricPCR)不对称不对称PCR大量扩增模大量扩增模板的一条链。板的一条链。定量PCR 严严格格地地掌掌握握实实验验条条件件，使使PCR扩扩增增产产物物量量与与模

13、模板板量量成成正正比比。这这样样可可将将不不便便于于直直接接测测定定的的痕痕量量的模板扩增后检测，按比例得到原模板的量。的模板扩增后检测，按比例得到原模板的量。此此 法法 常常 用用 于于 低低 丰丰 度度 mRNA的的 检检 测测。先先 将将mRNA反反转转录录成成cDNA，再再以以cDNA为为模模板板扩扩增增出出产产物物，检检测测产产物物的的量量从从而而推推算算出出低低丰丰度度mRNA的的量。这种方法称为反转录量。这种方法称为反转录PCR（RTPCR）。）。(quantitativePCR)定量定量PCR测定痕量模板的量。测定痕量模板的量。定量PCR中的内标 由由于于影影响响扩扩增增产产量

14、量的的因因素素较较多多，模模板板与与扩扩增增产产物物量量的的比比例例关关系系难难以以确确定定，所所以以必必须须在在同同一一次次PCR中中加加入入内内标标。在在一一次次PCR中中同同时时加加入入两两种种模模板板，一一种种是是待待测测模模板板，另另一一种种是是按按确确定定量量加加入入的的作作为为内内标标的的对对照照模模板板，二二者者使使用用相相同同的的引引物物，对对照照模模板板与与待待测测模模板板的的差差异异应应尽尽量量小小，以以便便最最大大程程度度地地减减少少扩扩增增效效率率的的系系统统误误差差。对对照照模模板板扩扩增增产产物物和和待待测测模模板板扩扩增增产产物物必必须须能能由由电电泳泳分分辨辨

15、出出来来，比比如如二二者者的的分分子子量量有有一一定定的的差差异异，或或是是二二者者序序列列中有限制酶切位点的差异。中有限制酶切位点的差异。荧光定量PCR 1995年年美美国国PerKinElmer公公司司研研制制成成功功具具有有革革命命性性意意义义的的荧荧光光定定量量PCR技技术术，它它融融合合了了PCR高高灵灵敏敏性性、DNA杂杂交交的的高高特特异异性性和和光光谱谱技技术术的的高高精精确确定定量量等等优优点点。荧荧光光定定量量PCR是是直直接接探探测测PCR过过程程中中荧荧光光信信号号的的变变化化以以获获得得定定量量的的结结果果，不不需需要要PCR后后处处理理或或电电泳泳检检测测，完完全全

16、闭闭管管操操作作，在整个过程中，仅有加入样品的一次开盖。在整个过程中，仅有加入样品的一次开盖。TaqMan荧光探针（线性探针）（线性探针）在在PCR扩扩增增体体系系中中加加入入一一个个特特异异性性的的、能能与与PCR产产物物中中部部杂杂交交的的荧荧光光探探针针，该该探探针针为为一一寡寡核核苷苷酸酸，两两端端分分别别标标记记一一个个荧荧光光报报告告基基团团（R）和和一一个个荧荧光光淬淬灭灭基基团团（Q）。探探针针完完整整时时，R基基团团发发射射的的荧荧光光信信号号被被Q基基团团吸吸收收，结结果果是是没没有有荧荧光光出出现现。PCR扩扩增增时时，Taq酶酶的的53外外切切活活性性将将探探针针酶酶切

17、切降降解解，使使R基基团团与与Q基基团团分分离离，Q基基团团对对R基基团团的的荧荧光光淬淬灭灭作作用用消消失失，于于是是产产生生荧荧光光信信号号。每每扩扩增增一一条条DNA链链，就就有有一一个个R基基团团分分离离，游游离离的的R基基团团数数量量（也也就就是是荧荧光光强强度度）与与PCR产产物物的的形形成成完完全全同同步步。通通过过检检测测荧荧光光强强度度的的变变化化，机内的电脑可以计算并直接给出初始模板的数量。机内的电脑可以计算并直接给出初始模板的数量。TaqMan荧光探针工作原理分子信标（环状探针）（环状探针）分分子子信信标标荧荧光光探探针针的的设设计计与与TaqMan荧荧光光探探针针相相似

18、似，只只不不过过探探针针的的5端端和和3端端的的一一小小段段序序列列被被设设计计成成互互补补的的，探探针针没没有有与与靶靶序序列列杂杂交交时时会会形形成成茎茎环环结结构构，R基基团团和和Q基基团团靠靠近近，不不能能产产生生荧荧光光。当当分分子信标与靶序列杂交时，茎环结构被展开，使得子信标与靶序列杂交时，茎环结构被展开，使得R基基团团和和Q基基团团分分开开足足够够远远，Q基基团团对对R基基团团的的荧荧光光淬淬灭灭作作用消失。余同前。用消失。余同前。SYBR荧光染料 在在PCR反反应应体体系系中中，加加入入过过量量的的SYBR荧荧光光染染料料，SYBR荧荧光光染染料料能能特特异异性性地地掺掺入入D

19、NA双双链链中中，产产生生荧荧光光信信号号，而而不不掺掺入入DNA双双链链中中的的SYBR荧荧光光染染料料不不会会发发出出荧荧光光。这这样样荧荧光光强强度就与双链度就与双链DNA的量成正比。的量成正比。荧光定量PCR仪光路图PCR产物与载体的连接解决办法：解决办法：1用用T4DNA聚聚合合酶酶除除去去PCR产产物物3端端多多余余的的核苷酸，成为平端后连接。核苷酸，成为平端后连接。2给给平平端端载载体体的的两两个个3端端各各加加上上一一个个T，使使其其与与3A突出的突出的PCR产物互补，然后连接。产物互补，然后连接。TaqDNA聚聚合合酶酶的的扩扩增增产产物物往往往往不不是是平平端端，而而是是在

20、在双双链链DNA产产物物的的两两个个3端端再再加加上上一一个个非非模模板板来来源源的的核核苷苷酸酸，A的的可可能能最最大大，这这样样有有碍碍于平端的连接。于平端的连接。PCR产物与载体的A-T连接mRNA差别显示利用PCR的定点突变引物引物1或引物或引物2的的5端有不与模板端有不与模板互补的突变。互补的突变。利用PCR的定点突变两段PCR产物连接处两段PCR产物连接处BIORAD公司的公司的PCR之歌之歌TherewasatimewhentoamplifyDNA,Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.ThenalongcameaguynamedDr.KaryMu

21、llis,Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,Nucleotidesandpolymerases,too.Denaturing,annealing,andextending.Wellitsamazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.PCR,whenyouneedtodetectmutations.PCR,whenyouneedtorecombine.PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.P

22、CR,whenyouneedtosolveacrime.二、二、DNA分子标记技术 DNA分分子子标标记记就就是是在在不不同同生生物物个个体体间间DNA序序列列上上的的差差异异，某某一一特特定定的的差差异异可可以以通通过过实实验验的的方方法法检检测测出出来来，测测出出来来的的特特定定差差异异就就是是特特定定的的DNA分分子子标标记记。利利用用不不同同的的实实验验方方法法可可以以得得到到许许许许多多多多的的DNA分分子子标标记记，这这些些DNA分分子子标标记记表表明明了这些个体间遗传物质上的差异。了这些个体间遗传物质上的差异。遗传标记的发展形态标记形态标记 细胞学标记（染色体多态性）细胞学标记（

23、染色体多态性）蛋白质标记（同工酶，分子标记）蛋白质标记（同工酶，分子标记）DNA标记（分子标记）标记（分子标记）RFLP 分析 RFLP（restriction fragment length poly-morphism）称称为为限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性。当当用用某某种种限限制制性性内内切切酶酶处处理理不不同同生生物物个个体体来来源源的的DNA时时，由由于于个个体体间间DNA序序列列的的差差异异，所所产产生生的的切切割割片片段段长长度度和和数数量量可可能能不不同同，利利用用凝凝胶胶电电泳泳可可以以将将这这些些片片段段分分离离并并观观察察到到差差异异，这这种种差差异异就就是是RF

24、LP。RFLP 分析 RFLP产产生生的的差差异异带带可可以以作作为为分分子子标标记记，用用于于遗传学的研究。遗传学的研究。当当一一个个生生物物有有多多条条染染色色体体，且且DNA分分子子很很大大时时，用用一一种种限限制制性性内内切切酶酶切切割割出出的的DNA片片段段太太多多，电电泳泳后的条带无法分辨。后的条带无法分辨。使使用用某某一一特特定定序序列列的的标标记记探探针针，与与电电泳泳分分离离的的片片段段进进行行Southern杂杂交交，再再显显示示出出杂杂交交带带，可可以以大大大大减减少少被被观观察察条条带带的的数数目目，便便于于不不同同生生物物个个体体间间的的比较和找出差异带。比较和找出差

25、异带。RFLP 分析 换换不不同同的的限限制制性性内内切切酶酶切切割割，配配合合不不同同的的标标记记探探针针，可可以以得得到到数数目目多多得得惊惊人人的的条条带带，从从而而找找到到很很多多的的分分子子标标记记。这这些些分分子子标标记记与与表表型型标标记记一一样样，可可以以用用于于遗遗传传学学的的研研究究。但但分子标记没有显隐性之分，都是共显性的。分子标记没有显隐性之分，都是共显性的。采用一种探针作 6 个栽培品种的RFLP分析RFLP所用探针的来源 RFLP分分析析的的效效率率依依赖赖于于选选择择合合适适的的探探针针。由由于于用用能能探探测测重重复复序序列列的的探探针针探探测测出出的的片片段段

26、太太多多，难难以以比比较较，所所以以探探针针一一般般来来自自单单拷拷贝贝或或低低重重复复序序列列。常常用用的的RFLP探探针针主主要要来来源源于于随随机机基基因组克隆和因组克隆和cDNA克隆。克隆。RFLP所用探针的来源 由由于于基基因因组组DNA中中甲甲基基化化一一般般很很少少在在表表达达基基因因中中发发生生，故故用用对对甲甲基基化化敏敏感感的的限限制制酶酶切切，可可得得到到长长度度为为12kb的的DNA片片段段，它它们们是是单单拷拷贝贝或或低低重重复复序序列列，用用这这些些片片段段制制成成文文库库，即即可可用作用作RFLP探针。探针。如如果果用用cDNA克克隆隆作作探探针针，最最好好制制备

27、备来来自自生生物整体物整体mRNA的的cDNA文库。文库。RFLP标记的共显性什么是多态性 多多态态性性是是在在不不同同个个体体之之间间比比较较得得到到的的差差异异带带，来来自自于于一一个个个个体体本本身身的的长长短短不等的片段不是多态性。不等的片段不是多态性。RFLP 标记的优点1.RFLP标标记记无无表表型型效效应应，不不受受环环境境条条件件和和发发育育阶阶段段的的影影响响。因因此此可可在在特特征征性性状状远远未未出出现现之之前前就就可可以知道其基因型。以知道其基因型。2.RFLP标标记记在在等等位位之之间间是是共共显显性性的的，因因此此不不受受杂杂交交方方式式的的影影响响。不不管管是是正

28、正交交、反反交交、回回交交，总总是是在在F1代中含有两亲本各一组染色体的片段之和。代中含有两亲本各一组染色体的片段之和。3.用用不不同同探探针针可可以以探探测测出出不不同同的的RFLP标标记记，标标记记的密度远远超过以性状为基础的图谱。的密度远远超过以性状为基础的图谱。RFLP 的不足 虽虽然然RFLP分分子子标标记记有有这这些些优优点点，但但实实验验步步骤骤较较多多，费费工工费费时时，费费用用也也高高，使使其其应应用用受受到到一一定定的限制。的限制。要要使使RFLP在在指指导遗传育育种种中中发发挥挥作作用用，还还必必须须将将RFLP与与已已知知性性状状联联系系起起来来，仅仅有有RFLP标标记

29、记图使用价值不大。图使用价值不大。可变数量串联重复（VNTRs）在在真真核核生生物物基基因因组组中中有有小小卫卫星星和和微微卫卫星星序序列列存存在在，它它们们是是短短序序列列（核核心心序序列列）高高度度重重复复的的序序列列，在在不不同同生生物物个个体体间间，某某一一座座位位上上的的核核心心序序列列重重复复的的次次数数有有很很大大差差异异，并并且且这这些些重重复复序序列列有有多多座座位位性性，因因此此形形成成了了高高度度的的多多态态性性。用用某某种种高高度度重重复复序序列列的的核核心心序序列列作作探探针针，测测定定其其RFLP，得得到到电电泳泳后后的的杂杂交交图图谱谱，这这种种图图谱称为指纹图谱

30、可以用来鉴别个体、亲子鉴定等。谱称为指纹图谱，可以用来鉴别个体、亲子鉴定等。VNTR一例The cause of the variation between individualgenomes at microsatellites or minisatellites is thatindividual alleles have different numbers of therepeatingunit.Forexample,oneminisatellitehasarepeatlengthof64bp,and is found in the population with thefollowi

31、ngdistribution:7%18repeats11%16repeats43%14repeats36%13repeats4%10repeatsVNTR差异带的检测父母子女间VNTR的检测结果VNTR应用举例 用用33.15（探探针针名名）进进行行白白种种人人的的DNA指指纹纹分分析析时时，两两个个无无血血缘缘关关系系的的个个体体具具有有相相同同DNA指指纹纹图图谱谱的的概概率率为为31011，而而当当把把33.15和和33.6两两个个探探针针取取得得的的结结果果综综合合分分析析时时，两两个个个个体体指指纹纹图图谱谱相相同的概率更是降低到同的概率更是降低到51019。随机扩增多态DNA（RA

32、PD）RAPD（randomly amplified polymorphicDNA）称称为为随随机机扩扩增增DNA多多态态性性。它它是是利利用用随随机机引引物物（通通常常为为10个个核核苷苷酸酸）对对不不同同生生物物个个体体基基因因组组DNA进进行行PCR扩扩增增，扩扩增增产产物物经经电电泳泳分分离离，溴溴化化乙乙锭锭染染色色，显显示示出出扩扩增增产产物物的的多多态态性性。不不同同个个体间差异的条带可以作为分子标记。体间差异的条带可以作为分子标记。RAPD的特点虽虽然然对对具具体体的的一一个个引引物物而而言言其其检检测测DNA多多态态性性的的位位点点是是有有限限的的，但但是是当当采采用用一一组

33、组引引物物时时，检检测测区区域域几几乎乎可可以以覆覆盖盖整整个个基基因因组组，从从而而得得到到整整个个基基因因组组DNA的的多多态性。态性。RAPD的的特特点点是是操操作作简简便便迅迅速速，不不需需要要标标记记探探针针。只只要有一套随机引物就能对任何物种进行要有一套随机引物就能对任何物种进行RAPD操作。操作。RAPD标标记记也也必必须须与与表表型型相相联联系系才才能能发发挥挥指指导导遗遗传传育育种的作用。种的作用。MAAP技术比较DAFAP-PCRRAPD引物长度引物长度(nt)5152034910引物浓度引物浓度(mmol/L)33030.3典型扩增产物条带典型扩增产物条带 1010035

34、0110分辨率分辨率 高高 中等中等 低低分离胶分离胶 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 琼脂糖琼脂糖显显色色 银银染染 放放射射性性标标记记 溴溴化化乙乙锭锭染染色色严谨度严谨度 低或高低或高 低和高低和高 低低(Multiple arbitrary amplicon profiling)DAF：DNAamplificationfingerprinting AP-PCR：arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction 序列标志位点技术 序序列列标标志志位位点点（sequencetagsites，STS）技技术术是是一一类类基基于于特特定定引引物物序

35、序列列形形成成的的，利利用用PCR技技术术进进行行的的分子标记技术。分子标记技术。SSR（SimpleSequenceRepeat）是是序序列列标标志志位位点点技技术术中中的的一一种种，它它以以某某一一微微卫卫星星座座位位两两侧侧的的单单一一序序列列设设计计引引物物，扩扩增增这这个个微微卫卫星星位位点点的的序序列列，然然后后电电泳泳检检测测产产物物的的大大小小。由由于于在在不不同同生生物物个个体体中中这这个个座座位位核核心心序序列列的的重重复复次次数数可可能能不不同同，同同一一个个体体的的两两条条染染色色体体的的这这个个座座位位核核心心序序列列的的重重复复次次数数也也可可能能不不同同（杂杂合合

36、体体），这这个个座座位位有有许许多多不不同同长长度度的的等等位位“基基因因”（复复等等位位“基基因因”）。SSR就就是是检检测测不不同同个个体体间间等等位位“基基因因”在在长度上的差异。长度上的差异。微卫星序列长度多态性测定微卫星序列长度多态性测定大豆大豆ATT5SSR位点位点14个等位基因的大小个等位基因的大小单核苷酸多态性单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)SNP是是指指基基因因组组内内DNA某某一一特特定定位位置置的的核核苷苷酸酸存存在在置置换换、插插入入、缺缺失失等等变变化化，而而且且其其中中最最少少有有一一种种等等位位基基因因在在群群体体

37、中中突突变变频频率率不不小小于于1%。SNP一一般般以以置置换为主，颠换与转换之比为换为主，颠换与转换之比为1:2。转转换换（transition）：用用另另一一种种嘌嘌呤呤碱碱基基代代替替原原有有的的嘌嘌呤碱基，或用另一种嘧啶碱基代替原有的嘧啶碱基。呤碱基，或用另一种嘧啶碱基代替原有的嘧啶碱基。颠颠换换（transversion）：嘌嘌呤呤碱碱基基被被嘧嘧啶啶碱碱基基所所代代替替或或嘧啶碱基被嘌呤碱基所代替。嘧啶碱基被嘌呤碱基所代替。SNP 的研究状况的研究状况 目目前前人人类类基基因因组组研研究究中中SNP的的研研究究最最为为广广泛泛。大大多多数数SNP对对蛋蛋白白质质无无直直接接的的影影

38、响响，因因为为绝绝大大多多数数的的SNP位位于于非非编编码码区区。目目前前已已有有的的人人类类基基因因组组SNP图图谱谱中中共共有有142万万个个SNP，但但只只有有约约4.23%的的SNP位位于于外外显显子内。子内。除除此此，在在果果蝇蝇、鸡鸡、犬犬类类、猪猪、绵绵羊羊、牛牛等等动动物物上上也也开开展展了了SNP研研究究。在在植植物物中中展展开开SNP广广泛泛研研究究的的种种类类则则较较少少，近近几几年年仅仅在在玉玉米米、大大麦麦、小小麦麦、番番茄茄、水稻等农作物上开展了此项工作。水稻等农作物上开展了此项工作。编码区内编码区内SNP 的意义的意义 在在基基因因组组DNA中中，任任何何碱碱基基

39、均均有有可可能能发发生生变变异异，因因此此SNP既既有有可可能能在在基基因因序序列列内内，也也有有可可能能在在基基因因以以外外的的非非编编码码序序列列上上。总总的的来来说说，位位于于编编码码区区内内的的SNP（codingSNP，cSNP）比比较较少少，因因为为在在外外显显子子内内，其其变变异异率率仅仅及及周周围围序序列列的的1/5。但但它它在在遗遗传传性性疾疾病病研研究究中中却却具具有有重重要要意意义义，因因此此cSNP的的研研究究更更受受关关注。注。SNP 的影响的影响 从从对对生生物物的的遗遗传传性性状状的的影影响响上上来来看看，cSNP又又可可分为分为2种：种：一一种种是是同同义义cS

40、NP（synonymous cSNP），即即cSNP所所致致的的编编码码序序列列的的改改变变并并不不影影响响其其所所翻翻译译的的蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列，突突变变碱碱基基与与未未突突变变碱碱基基所所在在的的密密码子的含义相同。码子的含义相同。另另一一种种是是非非同同义义cSNP（non-synonymouscSNP），指指碱碱基基序序列列的的改改变变可可使使以以其其为为蓝蓝本本翻翻译译的的蛋蛋白白质质序序列列发发生生改改变变，从从而而影影响响了了蛋蛋白白质质的的功功能能，这这种种改改变变常常是是导导致致生生物物性性状状改改变变的的直直接接原原因因。cSNP中中约约有有一一半半为为非

41、同义非同义cSNP。SNP 用作遗传标记的优点用作遗传标记的优点 SNP用作遗传标记具有以下优点：用作遗传标记具有以下优点：（1）SNP在在人人群群中中是是二二等等位位基基因因性性的的，在在任任何何人人群中其等位基因频率都可估计出来。群中其等位基因频率都可估计出来。（2）它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。）它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。（3）与与串串联联重重复复的的微微卫卫星星位位点点相相比比，SNP是是高高度度稳稳定定的的，尤尤其其是是处处于于编编码码区区的的cSNP，而而串串联联重重复复的的微微卫卫星星位位点点的的高高突突变变率率容容易易引引起起对对人人群群的的遗遗传传分分

42、析出现困难。析出现困难。SNP 用作遗传标记的优点用作遗传标记的优点（4）部部分分位位于于基基因因内内部部的的SNP可可能能会会直直接接影影响响产产物物蛋蛋白白质质的的结结构构或或基基因因表表达达水水平平，因因此此，它它们们本本身身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。（5）易易于于进进行行自自动动化化、规规模模化化分分析析，缩缩短短了了研研究究时时间间。由由于于SNP的的二二态态性性，非非此此即即彼彼，在在基基因因组组筛筛选选中中SNPs往往往往只只需需+/-的的分分析析，而而不不用用分分析析片片段段的的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测长度，这就利于发

43、展自动化技术筛选或检测SNPs。检测单核苷酸差异的方法检测单核苷酸差异的方法单链构象多态性（单链构象多态性（SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）DNA片片段段双双链链变变性性成成单单链链后后，在在非非变变性性条条件件下下会会折折叠叠成成不不同同的的空空间间构构象象，单单链链这这种种构构象象会会因因个个别别核核苷苷酸酸置置换换而而改改变变，长长度度相相同同或或相相近近的的单单链链在在电电泳泳时时由由于于构构象象不不同同而而具具不不同同迁迁移移率率，从从而而显显示示出出多多态态性性。在在SSCP分分析析时时，应应先先将将扩扩增增后后的的DNA片片段段

44、变变性性为单链，然后在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。为单链，然后在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。检测单核苷酸差异的方法检测单核苷酸差异的方法基因芯片法基因芯片法 其其基基本本原原理理是是利利用用DNA分分子子的的变变性性杂杂交交特特性性，通通过过DNA芯芯片片上上的的固固定定探探针针或或样样品品DNA与与游游离离样样品品DNA或或探探针针杂杂交交来来推推断断未未知知靶靶分分子子的的序序列列，杂杂交交发发生生与与否否可可采采用用荧荧光光标标记记技技术术来来检检测测。由由于于该该技技术术可可将将大大量量探探针针同同时时固固定定于于支支持持物物上上，所所以以一一次次可可以以对对大大量量DNA分分子子进进

45、行行检检测测分分析析，解解决决了了传传统统印印迹迹杂杂交交技技术术复复杂杂、自自动动化化程程度度低低、检检测测目目的的分分子子少少、效效率率低低的的问问题题。近近年年来来的的实实验验结结果果指指出出，一次实验就可以同时分析成千个多态性。一次实验就可以同时分析成千个多态性。检测单核苷酸差异的方法检测单核苷酸差异的方法 基因单碱基多态检测的芯片一般采用等长移位基因单碱基多态检测的芯片一般采用等长移位设计法，即按靶序列从头到尾依次取一定长度的互设计法，即按靶序列从头到尾依次取一定长度的互补的核苷酸序列形成一探针组合，这组探针是与靶补的核苷酸序列形成一探针组合，这组探针是与靶序列完全匹配的野生型探针，

46、然后对于每一野生型序列完全匹配的野生型探针，然后对于每一野生型探针，将其中间位置的某一碱基分别用其它三种碱探针，将其中间位置的某一碱基分别用其它三种碱基替换，形成三种不同的单碱基变化的核苷酸探针，基替换，形成三种不同的单碱基变化的核苷酸探针，这种设计可以对某一段核酸序列所有可能的这种设计可以对某一段核酸序列所有可能的SNPs位位点进行扫描。点进行扫描。基因芯片法基因芯片法基因芯片法测 SNP 的探针设计AAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAA

47、TAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAA

48、AAT 在芯片上，有如上序列在芯片上，有如上序列1-8的一组探针，还有的一组探针，还有9-16、17-24等组探针。（每一个探针的长度不一定是等组探针。（每一个探针的长度不一定是8）分子标记的应用领域 和经典的表型遗传图谱类似，也可以将分子和经典的表型遗传图谱类似，也可以将分子标记和表型标记混作于一张图中，用于遗传育种分标记和表型标记混作于一张图中，用于遗传育种分析。析。分子标记应与表型标记对应起来。分子标记应与表型标记对应起来。以分子标记制作的遗传图谱密度要比表型标记以分子标记制作的遗传图谱密度要比表型标记大得多，可以更精确地分辨不同个体的遗传差别。大得多，可以更精确地分辨不同个体的遗传差别

49、许多表型标记需要在生物个体发育到一定阶段许多表型标记需要在生物个体发育到一定阶段才能表现出来，而分子标记从胚胎期就可以分辨出才能表现出来，而分子标记从胚胎期就可以分辨出来。来。分子标记可用于个体鉴别和亲子鉴定。分子标记可用于个体鉴别和亲子鉴定。建立遗传图谱建立遗传图谱水稻的水稻的RAPD图谱图谱分子标记与性状的联系 近近等等基基因因系系（Nearlsogeniclines,NILs）几几乎乎仅仅在在目目的的性性状状上上存存在在差差异异，因因此此，一一般般凡凡是是能能在在近近等等基基因因系系间间揭揭示示多多态态性性的的分分子子标标记记，极极可可能能位位于于目目的的基基因因或或其其附附近近。如如

50、果果没没有有近近等等基基因因系系可可用用，也也可可以以采采用用分分离离群群体体分分组组分分析析法法（Bulkedsegregationanalysis,BSA）来来寻寻找找与与目目的的基基因因紧紧密连锁的分子标记。密连锁的分子标记。分离群体分组分析法 采采用用F2分分离离群群体体为为材材料料，根根据据目目的的基基因因的的表表型型把把F2群群体体分分成成两两组组（如如抗抗病病的的和和敏敏感感的的），在在每每组组内内，不不管管其其他他性性状状如如何何，其其目目的的基基因因的的表表型型都都是是一一样样的的，而而这这两两组组之之间间在在目目的的基基因因表表型型上上是是不不同同的的。将将每每组组内内一一