PCR检测技术及临床应用.ppt

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1、PCR检测技术及临床应用北京协和医院检验科韩建华具体内容nPCR技术简介nPCR引物的设计原则nRT-PCRn实时荧光定量PCR技术n罗氏公司的COBAS Amplicor乙肝定量检测仪一、PCR技术简介PCR简介 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）是1985年由K Mullis创立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。该技术在短时间内就可在体外扩增获得大量的目的基因，从而比较容易对目的基因进行分析鉴定，所以已被广泛应用于分子生物学的各个领域。PCR技术的基本原理 PCR在体外酶促扩增DNA的原理，类似于天然DNA的复制机制，主要是利用DNA聚合酶依赖

2、于DNA模板的特性，由变性-退火-延伸三个反应步骤完成：1.变性（denature）2.退火（annealing）3.延伸（extension）PCRPCR原理动画演示原理动画演示PCR的基本原理 整个PCR过程一般需要进行三十轮的循环。在最初的循环阶段，原来的DNA链起着模板的作用，随着循环次数的递增，新合成的引物延伸链急剧增多而成为主要的模板，而且PCR扩增产物将受到所加引物5末端的限定，其终产物序列是介于两种引物5末端之间的区域。PCR的基本原理 理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n-2n的指数方式递增，但由于DNA聚合酶的质量、待增片段的序列及反应系统的条件等多

3、种因素的影响，实际扩增效率比预期的要低。PCR的基本原理 PCR反应中，当引物-模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化的反应趋于饱和，出现“平台效应”，即PCR反应产物不再增加。这主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等。标准的PCR反应体系 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应成分 1 TaqDNA聚合酶:是影响PCR反应的重要因素，不同的PCR反应都有最适聚合酶用

4、量。2 引物浓度：一般为0.1-0.5mol/L。3 Mg2+：可影响DNA聚合酶的活性，提高双链DNA的解链温度，一般为1.5-2.0 mol/L PCR反应成分 4 dNTP：取决于扩增片段的长度、Mg2+浓度、引物浓度等反应条件，一般为50-200 mol/L。5 模板：在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高。6 添加剂：如：二甲基亚砜等PCR反应特点 1、特异性强：聚合酶合成反应的忠实性及 Taq DNA聚合酶耐高温性。2、灵敏度高：PCR产物能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。3、简便、快速：一次性地将反应液加好后，一般在24 小

5、时即可完成扩增反应。4、对标本的纯度要求低：可直接用临床标本 如血液、体腔液等粗制的DNA扩增检测。PCR扩增产物的分析 PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。PCR产物分析凝胶电泳分析酶切分析分子杂交核酸序列分析琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳Southern印迹杂交斑点杂交PCR常见问题1 1、假阴性，不出现扩增条带、假阴性，不出现扩增条带 模板模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有杂蛋白质，模板中含有模板中含有TaqTaq酶抑制剂，酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化干净，

6、特模板中蛋白质没有消化干净，特别是染色体中的组蛋白，别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。模板核酸变性不彻底。酶失活酶失活：有时忘加：有时忘加TaqTaq酶或溴乙锭。酶或溴乙锭。引物引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是度是否对称，是PCRPCR失败或扩增条带不理想、容易失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。弥散的常见原因。1、假阴性、不出现条带 MgMg2 2浓度浓度：MgMg2 2离子浓度对离子浓度对PCRPCR扩增效率影响扩增效率影响 很大。很大。反应体积的

7、改变反应体积的改变：应用多大体积进行：应用多大体积进行PCRPCR扩增，扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定。是根据科研和临床检测不同目的而设定。物理原因物理原因：变性对：变性对PCRPCR扩增来说相当重要，如扩增来说相当重要，如 变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性 靶序列变异靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响：如靶序列发生突变或缺失，影响 引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引 物与模板失去互补序列，其物与模板失去互补序列，其PCRPCR扩增是不会成功的。扩增是不会成功的。2、假阳性

8、 引物设计不合适引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩：选择的扩增序列与非目的扩 增序列有同源性增序列有同源性 靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两：这种污染有两 种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导 致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染，这些小致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染，这些小 片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼 接，与引物互补后，可扩增出接，与引物互补后，可扩增出PCRPCR产物，而导致假产物，而导致假 阳性的产生。阳性的产生。3、出现非特异性扩增

9、带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多及酶的质和量等引起的。4、出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带 或地毯样带，其原因往往由于酶量过 多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2浓度过高，退火温度过低，循环 次数过多引起。PCR产生污染的原因 样品的交叉污染；PCR试剂的污染：如加样枪、蒸馏水等 产物的污染：最主要的是气溶胶DNA产 物溶于空气中；重组质粒的污染：阳性对照；标准品等 其它：培养物等 污染的

10、监测 阳性对照：要选择扩增度中等、重复性好，经各阳性对照：要选择扩增度中等、重复性好，经各 种鉴定是该产物的标本作为阳性对照。种鉴定是该产物的标本作为阳性对照。阴性对照：它包括阴性对照：它包括标本对照标本对照试剂对照试剂对照 重复性试验重复性试验 选择不同区域的引物进行选择不同区域的引物进行PCRPCR扩增扩增减少污染的方法 实验室分区：1、样品准备区（前处理）2、试剂准备区：必须保持干净无任何 尤其是DNA扩增产物的污染 3、扩增区：小心处理产物；区域内必须形成负压环境污染的处理方法 1.稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸 擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；2.紫外照射（UV）法：紫外波

11、长（nm）一 般选择254/300nm，照射30min即可。需要 注意的是，UV照射仅对 500bp以上长片段 有效，对短片段效果不大。PCR的类型1 1不对称不对称PCRPCR2 2多重多重PCRPCR3 3着色互补着色互补PCRPCR4 4巢居巢居PCRPCR5 5半巢居半巢居PCRPCR6 6二温式二温式PCRPCR7 7锚定锚定PCRPCR8 8反向反向PCRPCR9 9锅柄锅柄PCRPCR10ALU-PCR10ALU-PCR1111增敏增敏PCRPCR1212重组重组PCRPCR1313表达表达PCRPCR1414原位原位PCRPCR15RNA15RNA的聚合链反应的聚合链反应161

12、6差示差示PCRPCR1717竞争竞争PCRPCR二、PCR引物的设计原则如何构建一个成功的PCR反应？1、目的基因序列的获取 获取目的基因序列以制备扩增引物,对于 临床的检测项目其目的基因序列多为已知 的,其可从以下资源获得:GenBank http:/www.ncbi.nlm.nih.govEuropean molecular biology laboratory(EMBL)http:/www.ebi.ac.uk2、引物的设计与合成 引物的结合位置 此是由试验的目的决定的 a 若只是检测目的序列的有无,对引物的定位 无严格要求 b 若是检测某个基因的等位基因,那么扩增子 (amplicon

13、)中必须包括目的基因序列引物的设计与合成 引物长度 引物的特异性一般通过引物长度和退 火温度来控制,引物的一般长度为15-30bp,但其长度不应超过38bp,常用的是18-27bp.引物的长度增加其特异性增强,但会降低反 应效率引物的设计与合成 引物的3末端和5末端核苷酸 a 引物的3端是PCR延伸的起始端,不能进行任何修饰,应避免二级结构的形成;引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加;且应当避免在引物的3端使用碱基A.b 引物的5端仅限定PCR产物长度,他对扩增特异性影响不大,容许被修饰.引物的设计与合成 引物中GC的含量：一般为40%-60%.过高 或过低

14、都不利于反应.扩增子的大小：一般来讲,扩增子的大小应 在100-1000bp之间.避免引物自身和引物之间的互补 碱基的随机分布 避免引物形成二级结构及发夹结构 PCR引物的设计原则3、引物的浓度4、Taq酶的浓度5、Mg2+的浓度6、dNTP的浓度7、Tm的温度：DNA模板双链充分解链是PCR 成功的前提,在一般情况下Tm取93-94。8、设立实验对照三、RT-PCR逆转录-聚合酶链反应 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oli

15、go （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获 得目的基因或检测基因表达。RNA的抽提匀浆化作用分离阶段RNA的沉淀RNA的洗脱RNA的再溶解测RNA的纯度PCR扩增cDNA电泳操作步骤制备cDNA防止RNA酶污染的措施1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180的 高温下干烤6hr或更长时间。2、塑料器皿可用0.1%DEPC(二乙基焦磷酰胺)水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗 涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%双氧水室温10min，然后用0.1%DEPC水冲 洗，晾干。防止R

16、NA酶污染的措施4 4、配制的溶液应尽可能的用配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC0.1%DEPC，在，在3737 处理处理12hr12hr以上以上,然后用高压灭菌除去残留的然后用高压灭菌除去残留的DEPCDEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用不能高压灭菌的试剂，应当用DEPCDEPC处理过的无菌双处理过的无菌双 蒸水配制，然后经蒸水配制，然后经0.22m0.22m滤膜过滤除菌。滤膜过滤除菌。5 5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验 过程中手套要勤换。过程中手套要勤换。6 6、设置设置RNARNA操作专用实验室，所有器械等应为专操作专用实验室，所有器

17、械等应为专 用。用。RT-PCR的应用 分析基因的转录产物 获取目的基因 合成cDNA探针 构建RNA高效转录系统四、荧光定量PCR实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念

18、Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。荧光定量PCR的原理Ct值图解荧光阈值（Threshold）的设定 一般情况下把PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：Threshold=10SDcycle 3-15。Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知

19、样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Ct值和初始模板关系的数学模式初始模板：初始模板：X;X;PCRPCR扩增效率：扩增效率：p;p;扩增达到某个固定的阈值扩增达到某个固定的阈值A A时：时：X X (1+p)(1+p)CtCt=A=A对等式两边取对数：对等式两边取对数：lglg X+Ct X+Ct lg(1+p)=lg(1+p)=lgAlgA lglg X X=lglgA A lg(1+lg(1+p p)CtCt 由此可知样本初始模板浓度的对数与样本扩增的由此可知样本初始模板浓度的对数与样本扩增的CtCt值值呈呈线性相关线性相关荧光探针和荧光染料 TaqMan荧光探针：P

20、CR扩增时，Taq酶 的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqManTaqMan 荧光定量技术流程荧光定量技术流程12 3 4荧光探针和荧光染料 SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料 特异性的掺入DNA双链后，发射荧光信 号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增 加与PCR产物的增加完全同步。实时荧光定量PCR无需内标 实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统

21、定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：实时荧光定量PCR无需内标 CtCt值的重现性值的重现性：PCRPCR循环在达到循环在达到CtCt值所在的值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期）循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此，此时微小误差尚未放大，因此CtCt值的重现性极值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的内扩增，得到的C

22、tCt值是恒定的。值是恒定的。CtCt值与起始模板的线性关系值与起始模板的线性关系：由于：由于CtCt值与起值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对 未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCRPCR是一种采用外标准曲线定量的方法。是一种采用外标准曲线定量的方法。实时荧光定量PCR的应用 新药开发研究，人用药物及其他药物 超早期感染用药物及疗法的研究与开发 药物疗效研究，人用药物及其他药物 新的愈后指标的研究 新诊断及检验试剂的开发 血液检验漏诊率其它PCR定量技术 内参照法 竞争法竞争法 PCR-E

23、LISA五、罗氏的COBAS Amplicor乙肝检测仪世界上第一台用于临床诊断的PCR仪！n nNATNAT国际金标准国际金标准n nFDAFDA许可，许可，SDASDA注册注册n n全球销售过全球销售过42004200台台简介 COBAS Amplicor 乙肝检测仪是由Roche公司生产制造的，它采用的是PCR-ELISA的方法，可对人血清和血浆中的HBV DNA病毒进行定性检测。该分析方法允许同时对HBV靶值和HBV定量标准（QS）DNA进行PCR扩增HBV定量标准（QS）HBV定量标准是一种非传染性的线性化质粒，其包含了与HBV DNA靶值相同的引物结合位点和可以与HBV扩增子区别的

24、独特的QS扩增子探针结合区域。HBV QS以已知的拷贝数掺入每个个体标本中，通过标本的制备、PCR扩增、杂交及检测步骤与HBV靶值一同被处理。COBAS Amplicor检测仪通过计算HBV信号和QS信号的比值来得出HBV DNA的水平。DNA扩增/RNA逆转录后再扩增杂交光密度计测定与探针特异结合的扩增产物显色样本制备 C Cobasobas AmplicorAmplicor 基本工作原理基本工作原理操作步骤 1、标本的制备；2、用HBV特异性的互补引物对靶值DNA进 行PCR扩增；3、用特异于靶值的寡核苷酸探针对扩增产 物进行杂交；4、通过比色仪来检测探针结合的扩增产 物。仪器简化检测工作

25、流程温育，杂交冲洗，留下与探针结合的扩增子CN4探针温育，CN4与生物素结合冲洗，洗去多余的CN4SB3温育，SB3在CN4的作用下显色检测，660nm处测吸光度变性液Amplicon 稀释液稀释液3号样本扩增稀释号样本扩增稀释液液 (1:729)样本原液样本原液(1:1)QS扩增原液扩增原液 (1:1)25 uL25 uL25 l+200 uL弃去弃去150 uL25 uL1号样本扩增稀释号样本扩增稀释液液 (1:9)QS(1:9)稀释液稀释液2号样本扩增稀释液号样本扩增稀释液 (1:81)25 uL25 uLCOBAS AMPLICOR MONITOR定量原理定量原理200 uL200 u

26、L200 uL25 uL模板扩增过程No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,57630 1,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 AmpliconMaster Mix组成成分Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPrTth DNA聚合酶聚合酶AmpEraseBiotinylat

27、edPrimerandORandTaqTaq酶酶AmpErase抗污染原理AmpErase新的新的PCRPCR实验开始实验开始前，前，5050保温保温5 5分分钟，钟，AmpErase激激活，切核酸链中活，切核酸链中U，降解可能存在的降解可能存在的前次扩增产物。进前次扩增产物。进入扩增循环后，入扩增循环后，95高温灭活高温灭活AmpErase，新合成新合成的的DNA不受影响。不受影响。仪器正面各部仪器工作区域各部全程自动化，严格防污染全程自动化，严格防污染全程自动化，严格防污染全程自动化，严格防污染2 2 个热循环区个热循环区个热循环区个热循环区 可同时作可同时作可同时作可同时作 24 24个

28、扩增个扩增个扩增个扩增2 2 个检测区个检测区个检测区个检测区 可同时作可同时作可同时作可同时作 24 24 个检测个检测个检测个检测自动取样单元自动取样单元自动取样单元自动取样单元 标准化自动量取样本和试剂标准化自动量取样本和试剂标准化自动量取样本和试剂标准化自动量取样本和试剂 扩增管和试剂盒保持密闭状扩增管和试剂盒保持密闭状扩增管和试剂盒保持密闭状扩增管和试剂盒保持密闭状冲洗平台冲洗平台冲洗平台冲洗平台 完成磁珠清洗完成磁珠清洗完成磁珠清洗完成磁珠清洗周密设计最大程度减少泡沫周密设计最大程度减少泡沫周密设计最大程度减少泡沫周密设计最大程度减少泡沫和气溶胶的形成和气溶胶的形成和气溶胶的形成和

29、气溶胶的形成试剂区试剂区试剂区试剂区试剂盒上条形码储存试剂种试剂盒上条形码储存试剂种试剂盒上条形码储存试剂种试剂盒上条形码储存试剂种类、剂量、类、剂量、类、剂量、类、剂量、效期等信息效期等信息效期等信息效期等信息试剂价可自动振动混匀试剂试剂价可自动振动混匀试剂试剂价可自动振动混匀试剂试剂价可自动振动混匀试剂试剂盒盖可被转运针头刺破试剂盒盖可被转运针头刺破试剂盒盖可被转运针头刺破试剂盒盖可被转运针头刺破系统封闭系统封闭系统封闭系统封闭光度计光度计光度计光度计自动本底设置自动本底设置自动本底设置自动本底设置外置磁铁将管内磁珠吸附至外置磁铁将管内磁珠吸附至外置磁铁将管内磁珠吸附至外置磁铁将管内磁珠吸附至检测光路之外检测光路之外检测光路之外检测光路之外仪器背面各部优势 国际金标准国际金标准 五合一的整合系统五合一的整合系统 全自动最大限度的减少了手工操作全自动最大限度的减少了手工操作 可同时进行可同时进行2 2个项目的扩增和检测个项目的扩增和检测 自动复查自动复查 灵敏度和特异性极佳灵敏度和特异性极佳 内对照消除假阴性内对照消除假阴性 AmpEraseAmpErase消除假阳性消除假阳性 维护方便维护方便 耗材之一：D-cups耗材之二：A-ring 谢 谢！