丙型肝炎病毒实验室检测技术规范.doc

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1、丙型肝炎病毒实验室检测技术规范 中国疾病预防控制中心 二一年五月二十日前 言丙型肝炎已呈全球性流行。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%，估计约1.7亿人感染HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。我国病毒性肝炎的发病人数一直位于所有传染病的前列，而丙型肝炎报告发病率在病毒性肝炎中也呈现上升趋势。丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎给人类带来了如此巨大的危害，在目前还没有疫苗的情况下，早期发现、早期治疗至关重要。然而，大众对于丙

2、型肝炎认知的欠缺、患者缺乏明显症状、在高危人群中早期发现丙型肝炎患者的机制的缺乏，都使丙型肝炎防治面临巨大的挑战。目前丙型肝炎病毒检测已经在疾病预防控制机构、医疗机构、采供血机构、出入境检验检疫机构等广泛开展，但是我国在丙型肝炎病毒实验室检测方面尚存在检测策略不明确、检测程序不标准、检测结果解释不规范等问题。临床实验室检测中存在大量的假阳性、假阴性结果。鉴于此，为加强全国丙型肝炎检测工作，提高实验室检测质量，急需制订关于丙型肝炎病毒实验室检测的技术规范。受卫生部委托，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心于2008年10月25日在北京召开了首次丙型肝炎病毒实验室检测技术规范（以下简称规范）

3、编写组工作会议。卫生部及中国疾病预防控制中心的有关领导从全国丙型肝炎防控管理角度，为规范编写内容提出了几点要求：1规范内容要考虑为公共卫生服务，要考虑到基层的具体情况。规范制订的标准要有实用性及可操作性。2规范内容要有发展的眼光，要考虑经济发展和技术进步。规范内容要有一定的前瞻性，要有较长的使用寿命。3规范内容要有大局观念，要考虑有利于各系统的发展。规范编写要借鉴国外经验、立足国内具体情况。随后，在卫生部和中国疾病预防控制中心有关领导的支持下，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心组织国内有关专家，历时近两年，经过反复多次修改，制订完成了我国丙型肝炎病毒实验室检测技术规范。规范共分九章，包

4、括：丙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒抗体检测，丙型肝炎病毒抗原检测，丙型肝炎病毒核酸检测，丙型肝炎病毒检测策略，丙型肝炎病毒细胞培养，实验样品的采集、保存、运输，丙型肝炎病毒检测实验室的室内质量控制及能力验证和实验室生物安全。现代医学的发展日新月异，新理论、新观点、新的诊断技术和新的防治策略不断出现，中国疾病预防控制中心将根据最新的临床医学证据适时组织专家组对本规范进行修改和更新。本规范主要起草单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。本规范参加编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制中心、北京大学医学部、北京人民医院、上海巴斯德研究所、中国药

5、品生物制品检定所、浙江大学医学院、北京市疾病预防控制中心。本规范编写组织者：蒋岩。本规范编写组人员：庄辉、魏来、鲁凤民、钟劲、祁自柏、陈智、周林福、汪宁、蒋岩、邢文革、邢玉兰、毕胜利。本规范编写联系人：邢文革。本规范适用于全国所有的丙型肝炎病毒检测实验室。本规范解释权属于中国疾病预防控制中心。本规范自发布之日起施行。丙型肝炎病毒实验室检测技术规范编写组2010年5月20日 于北京目 录第一章 丙型肝炎病毒11病毒形态和基因组结构12基因型23复制和细胞嗜性24致病性和免疫性3第二章 丙型肝炎病毒抗体检测51概述52试剂53检测方法及程序54抗体检测注意事项105抗体检测的意义116结果报告和解

6、释11第三章 丙型肝炎病毒抗原检测131概述132试剂133检测方法及程序144抗原检测注意事项145抗原检测的意义156结果报告和解释15第四章 丙型肝炎病毒核酸检测161丙型肝炎RNA定性检测162丙型肝炎病毒RNA定量检测173丙型肝炎病毒基因型检测23第五章 丙型肝炎病毒检测策略261疫情监测相关的检测策略262临床诊断相关的检测策略273血液筛查相关的检测策略30第六章 丙型肝炎病毒细胞培养321丙型肝炎病毒的细胞培养模型322体外细胞培养技术在丙型肝炎病毒检测中应用的展望33第七章 实验样品的采集、保存、运输351样品采集352样品保存与运输35第八章 丙型肝炎病毒检测实验室的室内

7、质量控制及能力验证371室内质量控制372能力验证41第九章 实验室生物安全461丙型肝炎病毒相关检测的生物安全级别462实验室生物安全保障措施473实验室安全操作484职业暴露及其处理50参考文献52ii第一章 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒（HCV）于1989年被正式命名，在此之前被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎病毒。1991年被归为黄病毒科（Flaviviridae）。虽然丙型肝炎作为疾病早已被发现，但直到2005年HCV体外细胞培养才获得成功。这对进一步认识HCV结构与功能、深入研究HCV的发病机制、研究和开发抗HCV药物和疫苗具有重要意义。1病毒形态和基因组结构HCV是一种有包膜的RNA病

8、毒。病毒体为直径4060nm的球状颗粒，包膜表面有刺突结构。用有机溶剂提取去除包膜后，可暴露其中心的核衣壳，直径约33nm。经蔗糖梯度离心后，血清中的HCV颗粒分布于3个组分：浮密度为1.041.06g/ml者为与血清中脂蛋白结合的病毒颗粒；1.091.1g/ml者为游离的病毒颗粒；浮密度为1.171.24g/ml的病毒颗粒与血清中抗体结合以免疫复合物形式存在。在分类学上HCV属黄病毒科（Flaviviridae）丙型肝炎病毒属（Hepacivirus）。HCV是单股正链RNA病毒，基因组总长约9.6kb，编码单一的开放读框（open reading frame，ORF），可翻译成一个约300

9、0个氨基酸的前体蛋白。在HCV ORF两侧分别有一个5非编码区和3非编码区，均具有复杂的二级结构。5非编码区含有内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES），可直接与40S核糖体亚单位结合，启动HCV前体蛋白的翻译。翻译启动后首先产生HCV前体蛋白。由宿主细胞的信号蛋白酶和HCV自身编码的蛋白酶加工成约10个成熟的HCV编码蛋白。HCV结构蛋白位于前体蛋白的氨基末端1/3处，由宿主细胞的信号蛋白酶加工，包括核心蛋白（core）、2个包膜糖蛋白（E1、E2）和一个小的p7蛋白。非结构蛋白（NS）位于前体蛋白的羧基末端2/3处，包括NS2、NS3、NS4

10、A、NS4B、NS5A和NS5B，其加工由HCV自身编码的蛋白酶介导，其中NS2-3自身蛋白酶切割NS2和NS3间的连接，而NS3丝氨酸蛋白酶负责下游NS3至NS5B间的加工成熟（图1）。图1 HCV基因组结构及病毒蛋白注：阿拉伯数字代表各成熟蛋白的第一位氨基酸残基位置；细箭头所指处由宿主细胞的信号蛋白酶切割；实心粗箭头所指处由HCV NS2-3自身蛋白酶切割；空心粗箭头所指处由HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶切割。其中NS3-4A间的连接为顺式切割，而NS4A-NS5B为反式切割。2基因型依据基因序列的差异，可将HCV分为6个主要基因型及不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基

11、因型，以小写的英文字母表示基因亚型（如1a、2b、3c等）。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70%以上，欧洲、美洲和亚洲的流行株以1型和2型为主；4型主要流行于中东地区；南非以5型和6型为主。我国以1b和2a基因型较为常见，但以1b型为主；某些地区有1a、2b、3b和6a型的报道。3复制和细胞嗜性HCV主要感染肝细胞。首先，HCV与靶细胞表面的受体结合，进入细胞后脱壳将其基因组RNA释放到细胞浆中。在HCV5非编码区内的IRES指导下，HCV基因组RNA可作为信使RNA被翻译为一个大的前体蛋白，后者经宿主细胞和HCV自身编码的蛋白酶加工成为成熟的HCV基因产物，其中NS3到NS5B可组

12、成HCV的复制复合体，以HCV基因组RNA为模板，启动负链HCV RNA的合成。新合成的负链HCV RNA又可作为模板进行新正链及新负链HCV RNA的合成，其中一些正链HCV RNA可包装成为子代病毒，经高尔基体转运系统释放到细胞外（图2）。图2 HCV复制周期示意图4致病性和免疫性丙型肝炎的潜伏期为226周，平均约67周。多数（约80%）HCV感染者无症状或仅有轻微症状，如疲劳、食欲减退、右上腹部不适、搔痒等，黄疸很少见（20%）。50%80%的患者可发展成慢性丙型肝炎。有些患者不出现症状，发病时已呈慢性感染，慢性丙型肝炎的表现轻重不等。约20%的慢性丙型肝炎患者可在20年内发展为肝硬化，

13、一旦到肝硬化阶段，每年约有1%7%可进展为原发性肝细胞癌。我国约10%肝癌患者血中存在抗-HCV。目前丙型肝炎尚无有效疫苗可以预防，切断传播途径尤其是控制血液传播仍是最主要的预防措施。丙型肝炎的标准治疗方法是-干扰素和利巴韦林联合治疗，有助于尽早从血液和肝脏中清除HCV，并使患者的血液生化学指标及组织学改变恢复正常。人感染HCV后，可呈现四种类型的抗-HCV反应：（1）被动输入抗-HCV反应。多见于输入含高滴度抗-HCV血液者，于输血后抗-HCV即为阳性，5周后阴转，而后感染者自身产生抗-HCV，并可持续存在。（2）迟发性抗-HCV持续阳性反应。一般于输血后2022周或发病后1416周抗-HC

14、V阳转，并迅速达高水平，可持续阳性10年以上。（3）迟发性抗-HCV短期阳性反应。于输血后1921周或发病后911周抗-HCV阳转，但1年后转阴。（4）无反应。此种反应多见于一过性HCV感染者或免疫力低下者，抗-HCV始终阴性。目前多认为，HCV感染所致肝脏损伤主要来自机体对HCV的免疫应答。此外，有研究显示，HCV的核心蛋白可通过损伤线粒体功能，引起肝细胞氧化应激，间接导致肝细胞损伤。HCV感染者大约有25%能自动清除体内病毒。有证据表明，这是机体产生了较强的体液和细胞免疫应答所致，HCV感染后的转归被认为与细胞免疫关系更为密切。丙型肝炎患者康复后，仅有较低免疫力，可再次被同种或异种HCV株

15、所感染。也有同一患者感染多种基因型HCV的报道。 53第二章 丙型肝炎病毒抗体检测1概述丙型肝炎病毒抗体检测是丙型肝炎诊断的重要依据。自从1989年建立了抗-HCV检测方法以来，检测技术不断发展。到目前为止，已经在临床广泛应用的丙型肝炎病毒抗体检测技术包括酶免疫技术、胶体金快速检测技术、化学发光技术、荧光技术等。抗体检测广泛用于血液筛查、流行病学调查、临床诊断，为早期发现感染者和病人、早期治疗提供可靠的依据。2试剂抗-HCV目前常用的检测试剂包括：酶联免疫吸附试验、胶体金法快速试验、化学发光试验、免疫荧光试验、免疫印迹试验和蛋白芯片。使用抗-HCV试剂，必须是经过国家食品药品监督管理局注册，在

16、有效期内的试剂。应根据目的和试剂使用范围，选择抗体检测试剂。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。3检测方法及程序3.1抗体筛查试验包括酶联免疫试验、胶体金法快速试验、化学发光试验和免疫荧光试验。3.1.1抗-HCV酶联免疫试验3.1.1.1 试剂和原理间接酶联免疫法（ELISA）是抗-HCV检测常用的筛查方法。其基本原理是以HCV抗原包被固相载体，用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与被检样品中的抗-HCV反应，以邻苯二胺（OPD）或3，3，5，5四甲基联苯胺（TMB）等底物显色后，利用检测仪器根据颜色的深浅进行阴阳性结果判断。其主要反应过程如下：（1）试剂中包含重组抗原与固相载体连接形成

17、的固相抗原。（2）加入经样本稀释液稀释的被检样品，样本中的抗-HCV与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。（3）洗涤：固相载体上只留下抗-HCV。其他免疫球蛋白及样品中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（4）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。（5）加底物显色：利用分析仪分析结果。ELISA中通常用聚苯乙烯为固相载体，有微孔板、小管、小珠（beads）、微粒（microparticle）、磁性微粒等类型，后发展为硝酸纤维素膜、活化滤纸、硅片、尼龙、利用高分子材料合成的各种固相微粒等。不同形式的固相载体要

18、求不同的洗涤装置，并有其特殊的自动分析系统。目前临床诊断和采供血机构广泛采用第三代ELISA试剂，即采用基因工程制备的重组蛋白做为包被抗原制备的抗-HCV ELISA试剂进行抗体筛查。3.1.1.2 试验程序板式ELISA试剂均采用规格统一的812的96微孔板，与板式ELISA试剂配套使用的洗涤装置（洗板机等）、自动分析仪（酶标仪等）均为开放式的，适用于各家产品。其主要的试剂组分和试验程序如下：（1） 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照规定倍数稀释。（2） 稀释：每孔加入规定量样品稀释液。（3） 加样：分别在相应孔中加入一定量的被检样品或阴、阳性对照，轻轻振荡混匀。（4） 温育：按照说明

19、书用封板膜封板后置37温育。（5） 洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机设置相应洗涤时间和次数，最后一次尽量扣干。（6） 加酶：每孔加入规定量的酶标试剂。（7） 温育：按照说明书用封板膜封板后置37温育。（8） 洗涤：操作同5。（9） 显色：每孔按照说明书要求加入显色剂，轻轻振荡混匀，37避光显色。（10） 测定：每孔加入规定量终止液，轻轻振荡混匀，按照说明书设定酶标仪检测波长测定各孔OD值。微孔板以外的固相载体形式，其洗涤装置和自动分析系统均为试剂与仪器配套型的。自动化程度较高，精密度和重复性等指标也达到较高水平，但检测成本较昂贵。3.1.1.3判定标准（1）阴性对照的正常范围：一般情况下，阴性对

20、照孔读数规定值（若有1孔阴性对照读数大于规定值应舍弃，若有两孔或两孔以上阴性对照读数大于规定值，应重复试验）。（2）阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔读数规定值（若有1孔阳性对照读数小于规定值应舍弃，若两孔阳性对照读数小于规定值，应重复试验）。（3）根据试剂盒提供方法计算临界值（Cutoff）。（4）阴性判定：样品读数临界值（Cutoff）者为抗-HCV阴性。（5）阳性判定：样品读数临界值（Cutoff）者为抗-HCV阳性反应。如试剂有配套的自动分析系统，则系统会自动计算Cutoff值，并判定结果。3.1.2抗-HCV胶体金法快速试验3.1.2.1 试剂和原理近年来胶体金免疫渗滤试验（

21、胶体金法）方法日趋成熟，逐步在临床上得到广泛应用。该方法利用免疫胶体金技术，以间接法检测样品中的抗-HCV。检测时，样品中的抗-HCV与固定在硝酸纤维膜上的金标蛋白反应，形成复合物，经层析移动至检测条的检测区，被固定在硝酸纤维素膜上的HCV抗原捕获，形成一条阳性色带。未被结合的金标抗体移动至检测条的质控区，与包被在此的抗金标蛋白的二抗反应形成另一色带。该试剂具有操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度较高、无需特殊的实验条件及仪器设备，可用于抗-HCV筛查。此外，一些以纳米磁微粒作为标记物的新型抗-HCV快速检测试剂也开始投入使用。3.1.2.2 试验方法胶体金试剂一般采用试纸条或检测板：（1）检

22、测板：根据试剂说明书取规定量的待检样品加入检测板的样品孔或样品池中，再滴加入缓冲液；（2）试纸条：将试剂条箭头所指方向插入样品收集器内，待检样品液面直到标记线为止，确保浸没时间大于1015 秒。然后将试剂条从样品收集器中拿出，将之粘贴到测试卡上，再观察测试结果。不要将试剂条浸没位置超过标记线（具体时间规定按照说明书所示）。3.1.2.3 判定标准（1）阳性反应（+）：两条紫红色条带出现。一条位于测试区（T）内，另一条位于质控区（C）。（2）阴性（-）：仅质控区（C）出现一条紫红色条带，在测试区（T）内无紫红色条带出现。（3）无效：质控区（C）未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂条已变质

23、损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂条重新测试。如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。（4）注意事项：测试区（T）内的紫红色条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只有非常弱的色带也应判为阳性反应。3.1.3.化学发光试验3.1.3.1 试剂和原理化学发光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA）是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种：（1

24、化学发光标记免疫分析法：化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物acridiniumester（AE），是有效的发光标记物，通过起动发光试剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减小所产生的光量，从而增加灵敏度。（2）化学发光酶免疫分析法：从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent En

25、zyme Immunoassay，CLEIA）应属酶免疫分析，只是反应的底物是发光剂，操作步骤与ELISA分析完全相同。以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。该方法又分为如下几类： HRP 标记的CLEIA：常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺，是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧（过氧化阴离子O2-，单线态氧O2，羟自由基OH-，过氧化氢H2O2）存在下生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体

26、但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物， 在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH2H2O2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。 增强发光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassay，ELEIA）在发光系统中加入增强发光剂以增强发光信号， 并在较长时间内保持稳定， 便于重复测量， 从而提高分析灵敏度和准确性。 ALP标记的CLEIA所用底物为环1，22二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团金刚烷基，其分子中发光基团为芳香基

27、团和酶作用的基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。3.1.3.2 试验方法操作步骤与ELISA分析类似或完全相同。3.1.3.3 判定标准在阴性和阳性对照符合试剂盒质控要求的情况下，以信号值（Signal）/临界值（Cutoff）试剂盒注明的S/CO判定为抗-HCV阳性反应。根据试剂盒注明的（Signal/Cutoff）范围内或对弱阳性反应样本进行复试或补充试验，或判定为阴性。3.2 抗体补充试验抗体补充试验包括免疫印迹试验和蛋白芯片检测方法。3.2.1 抗-HCV免疫印迹试验3.2.1.1试剂和原理目前获美国FDA正式批准的抗-HCV补充试验试剂只有一种，即美国Chiron公司的重组免

28、疫印迹法试剂（RIBA）。RIBA HCV 3.0将C100、C22和NS3、NS5四种成分喷涂在硝酸纤维薄膜条上，并设置了两种不同浓度的人IgG对照带和一条hSOD对照带，用于内部对照和结果判断。其诊断HCV感染的敏感性高、特异性强，可检测针对HCV不同编码区抗原的抗体，且不需要特殊的仪器设备。因此常用来确证ELISA检测的结果。3.2.1.2试验方法 依照试剂说明书操作。3.2.1.3判定标准依照试剂判定标准判定结果。RIBA试剂检测时出现两条以上阳性带，判定为阳性。其中IgG control和IgG control均显色，且前者颜色深于后者，hSOD带不显色或色带低于IgG contro

29、l，以上条件成立则试验成立。抗体产生条带的判定依次为NS4、NS3、Core和NS5。若两条抗体带显色，判定为抗体阳性；若1条抗体带显色，判为疑似抗体阳性；若所有抗体带均不显色，判为抗体阴性。3.2.2 蛋白芯片检测技术3.2.2.1 试剂和原理蛋白芯片检测技术是一种自动快捷、灵敏特异、高通量的蛋白组学研究方法，是伴随着基因芯片发展起来的一项新型诊断技术，已成功地运用于自身抗体、肿瘤标志物等的检测。 用蛋白芯片的方法检测抗-HCV分片段，主要采用先进的蛋白芯片膜处理技术、点样技术、洗涤技术、标记技术等检测技术。检测原理基于间接免疫法，采用化学发光的方法。突破了传统的HCV酶联免疫试验（ELIS

30、A）检测试剂盒一次只能检测抗-HCV的局限，样品用量仅为ELISA的1/5，能同时检测样品中抗HCV Core、抗HCV NS3、抗HCV NS4、抗HCV NS5以及抗HCV总抗体5项指标，能使临床方便地了解抗-HCV中，Core，NS3，NS4和NS5 4种不同功能区抗体出现的情况及不同的临床意义。如抗-HCV Core滴度持续明显降低反映HCV RNA可能消失；抗-HCV NS3可用于早期诊断，下降或转阴提示治疗有效，是病毒血症水平降低或消失的敏感标志；抗-HCV NS4与疾病慢性化有关，反映总抗体水平；抗-HCV NS5与肝细胞坏死有关，用于急性感染的诊断。3.2.2.2 试验方法取出

31、制备好的芯片，加试剂盒规定倍数倍稀释的一定量血清样本以及阴阳性对照，37 温浴30分钟，反应终止后加入洗涤液，按照说明书要求的时间和次数进行洗涤，然后加入一定量相应标记的抗人Ig G 结合物，37 温浴30分钟，再按照说明书要求进行洗涤，根据试剂盒内二抗的不同标记类型直接进行扫描检测，或者加入底物或显色液进行检测。3.2.2.3 判定标准需要两条阳性带，才可判定为阳性，且抗原反应性1。4抗体检测注意事项4.1 检测要点（1）严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改；（2）注意防止交叉污染；（3）严格遵守实验室操作规程。4.2 检测中常见错误（1）稀释错误；（2）在加样时刮擦已包被抗原的微孔；（3）

32、不适当的使用滴管，用滴管加试剂时滴管应处于垂直位置且液滴要自由落下；（4）使用不适当的加样器枪头，加样器与枪头一定要匹配，否则会使取样加样不准；（5）不连贯的操作技术，每份样本及质控品要同样对待，同时要同一个技术人员加所有的样本及质控；使用全自动处理处理系统有助于减少人为因素的影响；（6）使用不适当的设备，设备使用前要保证经过了校准；（7）不适当的温度，试剂使用前要平衡至室温，孵育温度要准确，否则会改变反应的动力学，产生错误结果；（8）不同批号试剂中的组分混合使用。5抗体检测的意义抗-HCV检测最初被推荐用于检出HCV感染。在临床上，针对大多数患有肝脏疾病的病人，筛查检测的敏感性和特异性均较高

33、抗-HCV假阳性较为少见。然而，在HCV感染率低的人群中（如无偿献血员、现役或退役军人、普通人群、卫生保健从业人员、性病门诊就诊者），假阳性率较高，阳性预期值较低。抗-HCV产生假阳性的主要原因是：（1）高IgG血症：目前国内外的抗-HCV试剂均采用间接酶联免疫检测原理，间接法的一个重要影响因素是血清中所含的高浓度的非特异性IgG，IgG对聚苯乙烯有较强的吸附力，非特异性IgG可吸附到固相载体上或包被的抗原上造成假阳性；（2）类风湿因子的干扰：类风湿性关节炎患者血清或血浆中的类风湿因子为巨球蛋白IgM，可非特异性地吸附到固相载体上或包被的抗原上造成假阳性；（3）超氧化物歧化酶（SOD）的干扰

34、如EIA试剂所含的重组基因片段C-100为酵母菌产生的SOD融合蛋白，样品中SOD升高会造成抗-HCV假阳性结果；（4）用于试剂制备的HCV抗原不纯。用于生产抗-HCV的抗原主要有HCV核心区、NS3、NS4及NS5区蛋白，均为基因工程产物，如抗原的纯度太低，可产生非特异性反应。由于以上原因，不能单独依靠筛查试验阳性反应结果来判断一个人是否感染HCV。因此，筛查试验阳性反应的样品需应用具有更高特异性的补充试验进行确证分析。免疫印迹试验是具有高特异性的抗-HCV补充试验，用来确认筛查实验阳性反应的样品，其结果表示为“阳性”、“阴性”、“不确定”。免疫印迹试验阳性结果可判定抗-HCV阳性。确认抗

35、HCV阳性结果提示需要进行有关HCV感染的咨询和医学评价，包括进行HCV RNA和肝脏生物化学（如ALT）检测。6结果报告和解释6.1 根据筛查和补充试验结果进行报告的基本原则6.1.1 对于筛查试验阴性样品，无需做进一步检测，可报告为“抗-HCV阴性”。6.1.2对于筛查试验阳性反应样品，可选择“根据其S/CO比值”的方案或选择“不根据其S/CO”的方案直接进行补充试验。6.1.2.1根据其S/CO比值进行补充试验：对于高S/CO比值的筛查试验阳性反应样品，可报告为“抗-HCV阳性”，无需再做补充试验；对于低S/CO比值的筛查试验阳性反应样品，应进一步做补充试验。6.1.2.2直接进行补充

36、试验：对所有筛查试验阳性样品，进行免疫印迹试验；或先做核酸放大检测(NAT)，NAT阴性的样品，再进行免疫印迹试验。6.2 试剂盒规定的S/CO阈值的说明6.2.1 高S/CO比值：当S/CO比值特定的阈值时，其补充试验结果阳性的预测值95；6.2.2 低S/CO比值：其S/CO比值特定的阈值。低S/CO比值的比率与被检人群的感染率呈反比。第三章 丙型肝炎病毒抗原检测1概述由于HCV感染窗口期的存在以及某些耐受人群未发生血清阳转等因素，使HCV抗体检测不能准确反映患者体内HCV的感染状态。HCV抗原检测是近几年快速发展起来的一种新的检测HCV指标，与HCV RNA检测相平行。HCV抗原定量检测

37、可用于治疗效果的评价与预后判断。同时，免疫功能受损或缺陷的群体（如HIV感染者、长期透析的肾病患者、器官移植患者或先天性免疫功能缺陷患者）筛查HCV感染时，抗-HCV检测阴性时，可选择抗原检测。但是由于血清中HCV抗原含量很低，用常规的ELISA等方法很难检出低滴度的样品，因此，HCV抗原检测并没有进入临床实验室成为常规检测项目。2试剂美国Ortho公司生产的ELISA试剂采用双抗体夹心法定性或定量检测样品中游离的HCV核心抗原或总核心抗原（包括抗原抗体复合物和游离核心抗原）。其基本原理是：以基因工程核心抗原免疫小鼠后所获得的纯化抗-HCV核心抗原单克隆抗体作为固相包被物，用与固相包被物有不同

38、抗原决定簇的抗-HCV核心抗原单克隆抗体作为辣根过氧化物酶标记物，与样品中总的或游离的HCV核心抗原反应，OPD显色后进行定性或定量测定。该法不受待测样品中抗-HCV的干扰，检测结果准确可靠，在临床上可用于HCV血清阳转前的早期急性丙型肝炎诊断，抗-HCV阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析等。年09-Rad(+)(-) individuals, 雅培公司研发了Architect HCV Ag检测试剂。该试剂对10套血清盘进行检测，结果表明HCV抗原检测可将窗口期缩短至35.8天，并且抗原量与RNA水平呈平行变化趋势。试剂进一步提高了检测的灵敏度、特异性，同时可以实

39、现HCV抗原检测的自动化，提高了检测的精密度。Abbott Murex和Bio-Rad Monolisa推出了HCV抗原-抗体联合检测试剂盒。抗原-抗体联合检测试剂在抗原检测的灵敏度还有待于进一步提高。3检测方法及程序3.1 基于ELISA原理的HCV核心抗原检测大部分HCV抗原检测试剂检测的是样品中游离核心抗原以及和抗HCV-抗体结合的核心抗原，因此在进行ELISA之前需要加入尿素、盐酸及去垢剂等，以解离样品中的核心抗原-核心抗体免疫复合物。操作程序与一般的ELISA操作基本相同，即：第一步加入待测样品，孵育后，洗去未结合的成分，加入酶标记的抗核心抗原的二抗，孵育后显色，再加入终止液终止显色

40、用酶标仪在特定的波长测出吸光度值A（OD值），与试剂盒规定的Cutoff值做比，来进行阴性和阳性的判断。将HCV抗原的标准物质稀释成不同浓度的系列标准，还可进行HCV抗原的定量检测。以横坐标为HCV抗原的浓度（pg/ml ），纵坐标为OD值，绘制出标准曲线。测出待测样品的OD值以后，在标准曲线上查出抗原的浓度。如果待测样品的OD值超出标准曲线上最高抗原浓度的OD值，则需用阴性血清将样品稀释以后再行检测。3.2 基于化学发光法原理的HCV核心抗原检测2008年雅培研发的Architect HCV Ag试剂可实现抗原检测的全面自动化，整个操作在雅培Architect i2000进行，从而大大减少

41、了对实验者的操作要求，也提高了检测的精密度。4抗原检测注意事项HCV抗原检测操作过程中微量抗原的污染即可能造成假阳性结果，特别对于手工的ELISA试剂。因此操作中，需要佩戴干净的一次性手套进行操作，小心、连贯、精确加样的同时，要保证移液器枪头要垂直加样，防止溅液对相邻孔的污染；洗板要彻底，孵育的温度必须准确，孵育时间需严格遵循试剂盒说明的要求。 在雅培Architect HCV Ag检测试剂的检测中，需要避免在一台免疫分析仪上同时检测HCV抗原和HCV抗体，因为残留在上样探针上的抗-HCV检测试剂会对抗原检测产生干扰，造成假阳性的结果。检测HCV抗原前，需要对仪器的通道和探针进行5%次氯酸的清

42、洗以消除干扰。5抗原检测的意义5.1 HCV抗原定性检测作为HCV筛查的补充试验抗原检测有助于HCV感染窗口期患者、HCV抗体检测结果不确定患者或HCV阳性母亲所生婴儿是否罹患丙型肝炎的诊断，有助于对免疫受损或先天性免疫缺陷群体如HIV感染者、长期透析的肾病患者、器官移植患者或先天性免疫功能缺陷患者等HCV感染的筛查。5.2 HCV抗原定量检测可用于抗病毒治疗的监测与疗效判断在长效干扰素和利巴韦林的治疗中，抗原检测有助于预测病毒学应答。但抗原检测的临床意义尚需更多的循证医学研究结果的支持。6结果报告和解释6.1 结果的报告初次检测抗原阴性样品，判定为“阴性”；初次检测抗原阳性反应样品，需要双孔

43、复检。如果双孔复检结果均为阴性，判定为“阴性”；如果双孔检测结果至少有一份结果为阳性反应，则判定结果为“阳性”。6.2 阴性结果的解释由于目前抗原检测试剂的灵敏度较低，最灵敏的检测试剂只能达到相当于500 IU/ml水平的HCV RNA，因此阴性的结果并不能排除HCV现症感染的可能。6.3 阳性结果的解释现阶段，HCV抗原阳性仅作为HCV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。特别是对处于“灰区”的阳性结果，需要结合临床表现及HCV RNA、抗-HCV等检测结果来解释。第四章 丙型肝炎病毒核酸检测丙型肝炎病毒核酸检测主要包括HCV RNA定性、定量检测及HCV基因型检测。目前，HCV RNA检测主要

44、依赖于PCR技术，包括定性PCR检测和定量PCR检测，在我国临床实验室以TaqMan荧光定量PCR占主导地位；与此同时，也有其他不同于PCR的性能优良的核酸检测技术，如分支DNA技术（branched DNA，bDNA）和转录介导的扩增技术（transcription-mediated amplification，TMA）等与PCR并行存在，优势互补，在HCV的核酸检测上各自发挥其重要的作用。1丙型肝炎RNA定性检测1.1 试剂迄今为止正式通过美国FDA认证可用于血液筛检的试剂仅仅数种，包括罗氏公司的COBAS AmpliScreen HCV 2.0和西门子公司的Versant HCV RNA

45、定性检测试剂，前者基于PCR-ELISA原理，后者基于TMA原理。1.2定性PCR检测技术传统PCR定性检测HCV RNA需要三个步骤：对待测样品进行处理：通过裂解、纯化，提取样品中的HCV RNA作为PCR扩增的模板；采用逆转录PCR（RT-PCR）技术对提取到的HCV RNA进行扩增；检测PCR扩增产物，检测方法包括凝胶电泳和PCR-酶联免反应（PCR-ELISA）等。定性PCR有极高的灵敏度，痕量的病毒即可被检出，但由于需要对PCR产物进行电泳或者PCR-ELISA分析，因此实验室分区不合理、PCR操作及产物分析过程不注意防污染，便极易出现因污染导致的假阳性结果。另外，凝胶电泳使用的溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种生物突变诱导剂，具有致癌性，因此对操作者和环境存在潜在的污染危险，需要做好防护，并且对PCR产物进行生物安全处理后方可排放。90年代后期，随着荧光PCR检测技术的发展和成熟，定性PCR逐渐被代替。1.3 TMA技术TMA是一种利用MMLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA的反应系统。TMA使用的引物含有T7 RNA聚合酶结合位点，使得反转录合成的cDNA可以作为T7 RNA聚合酶的模板，在T7 RNA聚合酶的作用下合成大量的RNA拷贝。扩增出来的RNA重新进入TMA循环，成