克隆基因的表达PPT课件.ppt

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1、v 原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：特点：原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间不具

2、备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。pIJ486 是链霉菌的质粒（如下图所示），其中是链霉菌的质粒（如下图所示），其中 neo 和和 tsr 分别为新霉素和硫链丝菌素的抗性基因。分别为新霉素和硫链丝菌素的抗性基因。为了准确克隆并筛选出目的为了准确克隆并筛选出目的 DNA 片段的克隆，最片段的克隆，最为理想的插入位点是？说明其原因？为理想的插入位点是？说明其原因？位点为tsr内的EcoRV。当外源基因插入EcoRV位点时，硫链丝菌素基因失活。利用新霉素来筛选重组子。

3、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。列举两种外源基因转化的方法?如何提高其转化效率?CaCl2处理后的细菌转化或转染：低温和CaCl2处理制备感受态细胞，使细胞膜通透性增加，处于容易捕捉和接受外源DNA 的状态。电穿孔转化法：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。质粒的大小，拷贝数；受体细胞的状态；转

4、化的外在条件，如温度等;质粒与宿主菌的比例。建立了一个基因文库后，如何鉴建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆定一个携带目的基因的克隆?1 基因表达的机制基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录外源基因的起始转录 外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。原核生物启动子原核生物启动子诱导型启动子：诱导型启动子：组成型启动子：组成型

5、启动子：如如lac、trp、PR、PL、tac等的启动子等的启动子如如T7噬菌体的启动子噬菌体的启动子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。mRNA的的延伸与稳定延伸与稳定外源基因起始转录后，保持外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及的有效延伸、终止及稳定存在是稳定存在是外源基因有效表达的关键外源基因有效表达的关键。一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的发的mRNA转录提前终止的现象；转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不另一方面，又要存在正

6、常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。而增加外源基因表达的稳定性。外源基因外源基因mRNA的有效翻译的有效翻译外源基因外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：有效翻译必须考虑的基本原则：AUG(ATG)是首选的起始密码子。是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序互补结合的位点，该序列至少含有列至少含有AGGAGG序列中的序列中的4个碱基。个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基。个

7、碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。不同基因组使用密码子具有不同基因组使用密码子具有选择性选择性。主主密码子密码子（major codon）罕用密码子罕用密码子（rare codon）如果外源基因如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效率就低。率就低。1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性避免外源基因表达蛋

8、白降解的对策：避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白表达系统构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统1.5 目的基因沉默目的基因沉默基因沉默的基因沉默的作用机制作用机制位置效应的基因沉默：位置效应的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：是指基因在基因组中的是指基因在基因组中的位置对其表达的影响位置对其表达的影响是在是在DNA水平上的基因水平上的基因调控调控是在是在RNA水平上的基因水平上的基因调控调控基因激活基

9、因激活转录起始转录起始mRNA水平水平蛋白质水平蛋白质水平克隆基因的表达克隆基因的表达第一节第一节 基因表达的基本过程基因表达的基本过程第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达第三节第三节 外源基因在真核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达第四节第四节 提高外源基因表达效率的途径提高外源基因表达效率的途径基因表达基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。基因表达的基本过程基因表达的基本过程基因表达的基本过程基因表达的基本过程 基因的表达主

10、要涉及到两个过程：基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。转录和翻译。首先，目的基因通过转录首先，目的基因通过转录(transcription)形成形成mRNA（信使（信使RNA,messenger RNA)；然然后后，tRNA（转转运运RNA,transfer RNA）将将各各种种氨氨基基酸酸运运送送到到核核糖糖体体并并按按照照mRNA的的密密码码子子顺顺序序将将各各种种氨氨基基酸酸连连接接成成特特定定的的氨氨基基酸酸序序列列(translation)最最终终得得到到基基因因的的表表达达产产物物（蛋蛋白白质）。质）。基因表达机制1.外源基因的起始转录外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤，

11、转录起始的速率是基因表达的限速步骤。因此，启动子是关键。2.mRNA的延伸和稳定性外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。另外，mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。思考思考:基因表达与克隆基因表达的异同?表达的对象、过程、场所克隆基因的表达：克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中 表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。基因激活基因激活转录起始转录起始mRNA水平

12、水平蛋白质水平蛋白质水平原核中表达真核中表达外源基因用原核生物作宿主。用原核生物作宿主。A dividing E.coli 第一节第一节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子MCSSD序列序列终止子终止子大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠

13、杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰

14、九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例八、细菌表达载体举例原原核核基基因因表表达达识别原核细胞的识别原核细胞的启动子启动子，催化所有的，催化所有的RNA合成。合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点2.以操纵子为单位以操纵子为单位1.只有一种只有一种RNA多聚酶多聚酶乳糖操纵元（laclac operonoperon）的结构lacI I lacZ Z lacYlacY lacAlacA P PlacIlacI

15、P Placlac OOlaclacRNARNADNADNA lacZ Z lacYlacY lacAlacA lacI I乳糖阻遏物（单体、四聚体）乳糖阻遏物（单体、四聚体）乳糖阻遏物（单体、四聚体）乳糖阻遏物（单体、四聚体）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 渗透酶渗透酶渗透酶渗透酶 乙酰转移乙酰转移乙酰转移乙酰转移酶酶酶酶ProteinProtein乳糖乳糖乳糖乳糖 葡萄糖半乳糖葡萄糖半乳糖葡萄糖半乳糖葡萄糖半乳糖 增加乳糖的吸收增加乳糖的吸收增加乳糖的吸收增加乳糖的吸收 功能未知功能未知功能未知功能未知有意义链有意义链5 反意义链反意义链3 转录转录mRNA5 3 翻译翻译蛋白

16、质蛋白质NC5 3 3.转录和翻译偶联、连续进行。转录和翻译偶联、连续进行。4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。调控主要在转录水平上。含有一个启始密码子和一段同核糖体含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列。6.mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三

17、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例八、细菌表达载体举例原原核核基基因因表表达达二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项1.外源基因不能带有内含子。外源基因不能带有内含子。2.必须用必须用cDNA3.不能直接用真核基因组不能直接用真核基因组DN

18、A。4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。为何？一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后

19、的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例八、细菌表达载体举例原原核核基基因因表表达达大肠杆菌基因表达载体基本结构特征大肠杆菌基因表达载体基本结构特征三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。合成的序列。大大肠杆杆菌菌的的所所有有启启动子子中中都都有有两两段段一一致致顺序（序（consensus sequence）。1.启动子启动子-35 Box 和和-10 Box（1）启动子序列启动子序列 consensus sequences5-TTGACA-3 5-TATAA

20、T-3-10box（Pribnow Box）TTGACA TATAAT 转录起始位点转录起始位点17bp5 核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点。-35box原核启动子共有序列的功能原核启动子共有序列的功能2 翻译的起始位点翻译的起始位点核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCAS-DS-D序列距离序列距离AUGAUG的距离

21、也影响翻译的距离也影响翻译AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于位于SD序列下游。序列下游。ii）起始密码：）起始密码：全全酶是一个是一个5 5聚体，含有两个聚体，含有两个小小亚基基，和，和2 2两个大两个大亚基（基（和和），一个），一个亚基。基。3 RNA多聚酶多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录多聚酶转录tRNA，rRNA和和mRNA。结构结构4.转录终止子转录终止子内终止子内终止子 intrinsic terminator：E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有位置有一段一段反向回文顺序反向回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串A

22、称为内终止子，形成终止信号。，称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。段转录终止子。启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。延续。终止形成的原因：终止形成的原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了数降低，整个减弱了RNA 与

23、与DNA的互作的互作 茎环结构茎环结构 多聚多聚A/UA/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNA折叠折叠 U CC U GGCAUCGCGGCCGCGGCA A CCCAC UUUU3 DNARNA聚合酶聚合酶脱落脱落大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上。一般安置上全部的三全部的三个终止密码个终止密码

24、防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）。）。5.翻译终止密码翻译终止密码6.翻译增强子翻译增强子 Translation enhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前导序列（简称g10-L序列）序列）;大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR中富含中富含U的区段。的区段。211 基因表达的机制基因表达的机制1.1 外源基因的起始转录外源基因的起始转录 外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录

25、起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。原核生物启动子原核生物启动子诱导型启动子：诱导型启动子：组成型启动子：组成型启动子：如如lac、trp、PR、PL、tac等的启动子等的启动子如如T7噬菌体的启动子噬菌体的启动子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。必须是一种强启动子必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的总蛋白的10%-30%以上

26、以上。应呈现低水平的基础转录应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。便于表达毒性蛋白等。应是可诱导型的应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。用温度或化学试剂诱导。最佳启动子必须具备的条件最佳启动子必须具备的条件 7.基因工程常用的原核启动子基因工程常用的原核启动子 一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达

27、载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例八、细菌表达载体举例原原核核基基因因表表达达四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达细胞质中表达（1）包涵体（）包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白不溶性蛋白质质聚集折叠而成的晶体结构物。聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。形成原理未知。在大肠杆菌细胞内表达人生长激素在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human gr

28、owth hormone,hGH）。）。例：例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。缺点缺点 优点优点2.周质中表达周质中表达（1）周质（）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚机理目前不完全清楚优点：优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。被降解的少。由于需要穿过两层膜，大

29、肠杆菌只能分由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。太理想。用溶血素（用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性）基因构建分泌性融合蛋白；融合蛋白；使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分分泌到细胞外泌到细胞外的培养基中。的培养基中。3.胞外表达胞外表达或与细菌素释放蛋白（或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。共表达。一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三、原

30、核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例八、细菌表达载体举例原原核核基基因因表表达达一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中

31、的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例八、细菌表达载体举例原原核核基基因因表表达达载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。任何蛋白质融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因外源基因-TAG优点优点五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体

32、1.非融合型表达载体非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。哈佛大学的哈佛大学的Gilbert实验室建立的。实验室建立的。表达能力强。表达能力强。举例：例：pKK223-3 载体载体组成结构：组成结构：强启动子强启动子:tac（trp-lac）:trp的的-35区区lacUV5的的-10区区lac操纵基因操纵基因操纵基因：操纵基因：乳糖操纵子系统。乳糖操纵子系统。终止子：终止子：调节基因：调节基因：Lac I宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。

33、如如JM105菌。菌。rrnB的强终止子的强终止子rrnB强终止子强终止子S-D插入位点区插入位点区S-D序列和插入位点区：序列和插入位点区：tac PLac O S-D 插入位点区插入位点区rrnB T宿主宿主lac I载体的其余部分：载体的其余部分：来自来自pBR322质粒。质粒。表达诱导物：表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物阻遏物IPTG启动子载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。质中。如：如：pIN III系列：系列：2.分泌型

34、表达载体分泌型表达载体pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,（1）组成结构）组成结构Ipplac P lac O S-D/ATG ompa插入位点插入位点Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。启动子。调节基因：调节基因：lac I S-D序列和起始密码序列和起始密码ATG。分泌信号肽：分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位点区（多克隆位点）。插入位点区（多克隆位点）。强启动子：强启动子：pIN III-comA1表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌

35、体蛋白连接在一起的。体上的菌体蛋白连接在一起的。启动子：启动子：tac 操纵基因：操纵基因：lacP 调节基因：调节基因：lacI S-D序列序列3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统-pGEX系列系列（1）优点）优点（2）组成结构）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。便于融合蛋白的分离和纯化。22lacItac lac O S-D/ATG GST 插入位点插入位点 TGAlacPori：pBR322 ori 融合肽：融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱亲和层析柱分离纯化。分离纯化。（3）产物

36、提纯）产物提纯（4）产物分离）产物分离用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋因子可以把外源蛋白从白从GST上切下来。上切下来。柱（柱（column）GST 外源蛋白外源蛋白凝血酶凝血酶 外源蛋白外源蛋白柱（柱（column）GSTGST洗脱洗脱柱（柱（column）可再利用可再利用（5）其他融合蛋白系统）其他融合蛋白系统His-tag（组氨酸标签）：（组氨酸标签）：在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸个组氨酸（His）。）。His-tag能与能与Ni2+柱柱结合，但很容易被结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。纯化蛋

37、白质。人胰岛素人胰岛素在大肠杆在大肠杆菌中的表菌中的表达达溴化氰溴化氰Cyanogen bromide：一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷八、

38、细菌表达载体举例八、细菌表达载体举例原原核核基基因因表表达达5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素1.启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点（1）一致顺序）一致顺序（2）-35区与区与-10区之间的距离区之间的距离间隔为间隔为17bp时，启动子最强。时，启动子最强。（3）-35区和区和-10区的碱基顺序区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACA TATAAT 一致顺序一致

39、顺序lactrp PL recAtac Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT-35box-10box5-AGGAGGU-3 S-D序列后面的序列后面的4个碱基：个碱基：如果是如果是A（T）,翻译效率最高；翻译效率最高；如果是如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。2.转译起始序列对表达效率的影响转译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列序列？SD 序列与16Sr分子之间的碱基互补程度，可明显地影响mRNA的转译速率当

40、序列为，可与16Sr端完全互补，转译效率最高；而当该序列发生单碱基突变时，转译效率便会下降倍AUG左侧的三个碱基也有影响。左侧的三个碱基也有影响。（2）起始密码）起始密码AUG-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA中：中：AUG左侧如果是左侧如果是UAU或或CUU时，最时，最为有效；为有效；如果是如果是UUC、UCA或或AGG时下降时下降20倍。倍。AUG右侧的三个碱基也有影响。右侧的三个碱基也有影响。多顺反子的多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有与核糖体的结合位点有一个或几个一个或几个终止密码终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核的核糖体结合位点糖体结合位点

41、有多个有多个U。（3）其它其它终止子能有效控制目的基因mRNA的长度、提高mRNA的稳定性3.启动子与外源基因之间的距离启动子与外源基因之间的距离转录终止区的存在保证载体转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基不会转录非必须基因因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。达。增加载体的拷贝数会增加转录出的增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。数目。增加表达效率。4.转录终止区对表达效率的影响转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响外源蛋

42、白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。一、原核生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核

43、细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例八、细菌表达载体举例原原核核基基因因表表达达1.选择强启动子序列，如选择强启动子序列，如tac 等等七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法2.调整调整S-D序列与序列与AUG碱的距离碱的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。根据不同的启动子选择不同的距离。3.改变起始密码下面的几组密码子改变起始密码下面的几组密码子一般为一般为5-9bp。能提高翻译的起始效率。能提高翻译的起始效率。4.增加增加mRNA的拷贝数和稳定性的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入在外源基因的下游插入“重复

44、性基因重复性基因外回文序列外回文序列”能防止能防止mRNA受到受到35外切酶的攻击。外切酶的攻击。5.减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达）诱导表达 一般采用温度诱导或药物诱导。一般采用温度诱导或药物诱导。cI857阻遏物有活性，抑制阻遏物有活性，抑制 PL启动子，启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。外源基因不表达，宿主大量生长。32C:42C:cI857阻遏物失活，阻遏物失活，PL启动子启动，外启动子启动，外源基因

45、高水平表达，宿主生长受到限源基因高水平表达，宿主生长受到限制。制。cI857PL外源基因外源基因PO PL启动子是温度诱导型启动子是温度诱导型调节基因调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。始终产生阻遏物。无无IPTG:阻遏物与阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。源基因转录。宿主大量生长。有有IPTG:阻遏物与阻遏物与IPTG结合，结合，lac操纵基因解操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。抑制。tac启动子是药物诱导型启动子是药物诱导型（2）表达载体诱导复制

46、表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量当宿主大量生长后生长后，再诱导载体制粒的，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。复制，增加拷贝数。当需要宿主大量当需要宿主大量生长时生长时，抑制载体质，抑制载体质粒的复制。粒的复制。N末端：由原核基因编码一段多肽，末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。（1）设计成融合蛋白）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物质粒基因产物 目的基因产物目的基因产物NC切割切割6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降

47、解。防止被宿主的酶降解。Z系列载体：系列载体：ZUV5载体载体:lac ZG AATTCCTTAA G外源基因外源基因 Z2载体载体:lac ZGGG AATTCCCCTTAA G外源基因外源基因 Z3载体载体:lac ZGG AATTCCCTTAA G外源基因外源基因提供三种融合插入阅读框。提供三种融合插入阅读框。使用次黄嘌呤核苷（使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。减少宿主菌的蛋白酶合成。大肠杆菌的大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶基因突变也减少蛋白酶的降解作用。的降解作用。T4噬菌体的噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋基因产物能抑制细菌的蛋

48、白酶。可把白酶。可把pin增加到载体上。增加到载体上。（2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。（3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白 细胞质细胞质外膜外膜内膜内膜周间质周间质质粒质粒染色体染色体“外排外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。细菌蛋白分泌的条件：细菌蛋白分泌的条件：位于位于N端，一般为端，一般为15-30aa。真核与原。真核与原核的结构相似核的结构相似,功能相似，可以互换

49、功能相似，可以互换。碱性氨基酸碱性氨基酸N疏水氨基酸核心区疏水氨基酸核心区切割位点切割位点Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶信号肽酶外源蛋白外源蛋白 有信号肽。有信号肽。细胞内的转运机制。细胞内的转运机制。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。信号肽酶信号肽酶I、信号肽酶、信号肽酶II等近等近20多种多种蛋白质的参与。蛋白质的参与。蛋白质蛋白质内内有与有与分泌相关的分泌相关的aaaa 序列。序列。为蛋白指明目的地。为蛋白指明目的地。23一、原核

50、生物基因表达的特点一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷十、原核细胞表达的缺陷八、原核表达系统八、原核表达系统原原核核基基因因表表达达九、外源蛋白质表达后的正确修饰九、外源蛋白质表达后的正确修饰