土壤中分解尿素的细菌的分离和计数.ppt
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1、一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H2O 1 1、实例:、实例:启示:启示:寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求,提供有利于目的菌株生长的条件。
2、求,提供有利于目的菌株生长的条件。原因:原因:因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C,淘汰了绝大多,淘汰了绝大多数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是一是一种在体外将种在体外将少量少量DNADNA大量大量复制复制的技术,此项技术的技术,此项技术要求使用要求使用耐高温耐高温(93930 0C C)的)的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNa
3、H2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 42 2、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:从物理性质看此培养基属于哪类?从功能上从物理性质看此培养基属于哪类?从功能上属属于哪类培养基?于哪类培养基?固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源?在此培养基中哪些作为碳源、氮源?碳源:碳源:葡萄糖葡萄糖 唯一氮源:唯一氮源:尿素尿素选择培养基选择培养基培养基的唯一培养基的唯一氮源为尿素氮源为尿素,只有能合成,只有能合成脲酶脲酶的微的微
4、生物才能分解利用尿素。生物才能分解利用尿素。缺乏缺乏脲酶的微生物由于脲酶的微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。3 3、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基:选择培养基:在微生物学中,将允许特在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。种类微生物生长的培养基。(1 1)将土壤中的固氮菌分离出来)将土壤中的固氮菌分离出来(2 2)将土壤中
5、自养微生物分离出来)将土壤中自养微生物分离出来举一反三(3 3)筛选出抗青霉素的微生物)筛选出抗青霉素的微生物(4 4)筛选出耐高浓度食盐的微生物)筛选出耐高浓度食盐的微生物1 1、显微镜直接计数:、显微镜直接计数:利用利用血球计数板血球计数板,在显微镜下计算一定容积里,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目:统计菌落数目:计数板是一块特制的载玻片,上面有一个特定计数板是一块特制的载玻片,上面有一个特定的面积(的面积(1 mm1 mm2 2)和高()和高(0.1 mm0.1 mm)的计数室,在)的计数室,在1 mm1 mm2 2的面积里又被划分成的面积里
6、又被划分成2525个(或个(或1616个)中格,个)中格,每个中格进一步划分成每个中格进一步划分成1616个(或者个(或者2525个)小格,个)小格,但计数室都是由但计数室都是由400400个小格组成。个小格组成。计数室计数室操作:操作:将清洁干燥的血球计数板将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片盖上盖玻片,再将,再将稀稀释的样品滴释的样品滴在计数板上,然后在显微镜下统计在计数板上,然后在显微镜下统计4 45 5个中个中格中的细菌数,并求出每个小格所含细菌的平均数,再格中的细菌数,并求出每个小格所含细菌的平均数,再按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。计算公
7、式:计算公式:每毫升原液所含细菌数每小格平均细每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数菌数4001000040010000稀释倍数。稀释倍数。1 1、显微镜直接计数:、显微镜直接计数:利用利用血球计数板血球计数板,在显微镜下计算一定容积里,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目:统计菌落数目:不能区分死菌与活菌;不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数;不适于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度;需要相对高的细菌浓度;个体小的细菌在显微镜下难以观察;个体小的细菌在显微镜下难以观察;缺点:缺点:2.2.间接计数法(间接计数法(活菌计数法)活菌计数法)(1
8、1)常用方法:)常用方法:每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中,其中,C C代表某一稀释度下平板上生长的平均代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,菌落数,V V代表涂布平板时所用的稀释液的体代表涂布平板时所用的稀释液的体积积(ml)(ml),M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。当样品的稀释度足够高时,培养基表当样品的稀释度足够高时,培养基表 面生长的一个菌落,来源于样品稀释面生长的一个菌落,来源于样品稀释 液中的一个活菌,通过统计平板上的液中的一个活菌,通过统计平板上的 菌落数,就能推测出样品中大约含有菌落数,就能推测出样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。(2)原理:)
9、原理:稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。说明设置重复组的重要性。在在设设计计实实验验时时,一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板,作作为为重重复复组组,才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性。在在分分析析实实验验结结果果时时,一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的重重复复组组的的结结果果是是否否一一致致,结结果果不不一一致致,意意味味着着操操作作有有误误,需需要要重新实验重新实验。注意事项注意事项为了保证结果准确,一般选择菌落数在为了保证结果准确,一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度
10、加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中,经涂布,培养计算出,经涂布,培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。信度。对照实验是指对照实验是指除了被测试的条件外,其他条除了被测试的条件外,其他条件都相同的实验。满足条件的是对照组,未件都相同的实验。满足条件的是对照组,未满足条件的是实验组。满足条件的是实验组。.设置对照:设置对照:判断培养基中是否有杂菌污染:
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