植物样蔗糖淀粉可溶性总糖测定.docx

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1、蔗糖，淀粉，可溶性总糖测定Slg干样（过IOO目筛） 冷热ml 80%乙醇I 80水浴301皿 jl2000rpm 离心 20min 冷排ml 80%乙醇i80C 水浴 30 min 200OrPm 离心 20min残渣冷却ml 80%乙醇I 80水浴30111出残t杏 200OrPm 离心 20min80C烘干冷却冷却bn 2ml蒸馆水物般潜冰油4不断搅动 加尔也ft1不断振荡2000rpm 离心 25min残渣I 2ml 4.6N HClO4 康QffliP不断振荡过滤1 r 残渣合并上清液 定容至50ml0.1ml 2N NaOHVr沸水浴IOmin4ml0.2%葱酮试剂（用浓H2SO4

2、配制）摇匀冷却15min沸水浴Iml 0.1%间苯二酚80C水浴HRN HCl冷却冷却比色ODjoo比色OIXjo淀粉测定（方法同可溶性总糖）:注意，加慈酮试剂时，试管置于冷水浴中:测蔗糖用0.9l蒸储水+0.1ml2N NaOH+Iml 0.1% 间笨二酚+3ml ION HCl作参比；测可溶性糖用2ml蒸储水+4ml慈酮试剂作参比。）碘我们也是彳1：保证每管中参加的5ml（可以使用大肚管）0.2%葱酮硫酸溶液与3.0ml（可以使用5ml的刻度管，但是必须标定）必须准确！2：保证每管的反响时间是完全的6分钟（拿秒表来计算，差异为正负3秒），这个可以两个人进行配合。3：振荡时尽量使溶液混合均匀

3、如果在较短的时间没法混合均匀，建议振荡40秒一1分钟。4：从振荡开始计算，到吸收度测定结束的时间至，必须控制在30分钟以内（标准规定是20-40分钟）。5：0.2%葱酮硫酸溶液必须在实验前就配制好，由于硫酸的密度较大，建议在样品配制好以前1小时配制好，参加试管时一定要摇匀。6：为了保证试验的准确度，建议每个样品平行测定3d管，这样的话可以消除由于自己的操作失误造成的试验结果不准确！以上几点时我在实验中发现并及时注意的几点经验，希望对楼主有所帮助！1 .葡萄糖标准曲线的制作：准确称取010Oog（在85烘箱中烘2小时）葡萄糖，溶解并定容至100OmI,即成0.1mgml葡萄糖母液，按下表分别吸

4、入20ml具塞刻度试管中0.1mgml葡萄糖母液（ml）蒸储水（ml）葡萄糖（ml/管）以下操作同可溶性糖的测定2 .蔗糖标准曲线的制作：准确称取0.10Oog(在85C烘箱中烘2小时)葡萄糖，溶解并定容至100omL即成0.1mgml葡萄糖母液，按下表分别吸入入ml具塞刻度试管中0.1mgml葡萄糖母液(ml)蒸储水(ml)蔗糖(ml/管)以下操作同可蔗糖的测定3 .计算从标准曲线上算得葡萄糖的mg数X稀释倍数可溶性糖含量(mgg)=样品重Ig)从标准曲线上算得蔗糖的mg数X稀释倍数蔗糖含量(mgg)=样品重(g)从标准曲线上算得葡萄糖的mg数X稀释倍数义淀粉含量(mgg)=样品重Ig)实验

5、24植物组织中可溶性糖与淀粉的测定植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。一、苯酚法测定可溶性糖【原理】植物体内的可溶性糖主要指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10100Ug范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，根本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定16Omin以上。【仪器与用具】

6、分光光度计；电炉；铝锅；20ml刻度试管；刻度吸管5ml1支，Iml2支；记号笔；吸水纸适量。【试剂】1. 90%苯酚溶液称取90g苯酚(AR),加蒸储水IOml溶解，在室温下可保存数月；2. 9%苯酚溶液取3ml90%苯酚溶液，加蒸储水至30ml,现配现用；3. 浓硫酸（比重）；4. 1%蔗糖标准液将分析纯蔗糖在80下烘至恒重，精确称取。加少量水溶解，移入IOoml容量瓶中，参加浓硫酸，用蒸储水定容至刻度；5. 100ugZml蔗糖标准液精确吸取1%蔗糖标准液ImI参加100mI容量瓶中，加水定容。【方法】1 .标准曲线的制作取20ml刻度试管11支，从010分别编号，按表24/参加溶液和水

7、表24.1各试管加溶液和水的量管号012345678910100gml蔗糖液(ml)0水(ml)蔗糖量（Hg）020406080I(X)然后按顺序向试管内参加Iml9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速参加5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml,在恒温下放置30min,显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。2 .可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净外表污物，剪碎混匀，称取，共3份，或干材料。分别放入3支刻度试管中，参加510ml蒸储水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反

8、复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3 .测定吸取样品液于试管中（重复2次），加蒸储水，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别参加苯酚，浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。CVC-.na可溶性糖含量（mgg）=部Xloi式中C一标准方程求得糖量（Ug）；a吸取样品液体积（ml）；V提取液量（ml）；n一稀释倍数；W-组织重量（g）o二、意酮法测定可溶性糖【原理】糖在浓硫酸作用下，可经脱水反响生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与慈酮反响生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色深浅与糖含量成正比，故可用于糖的定量。该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合

9、物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类,包括淀粉、纤维素等（因为反响液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反响），所以用慈酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用葱酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，那么应注意切勿将样品的末溶解残渣参加反响液中，不然会因为细胞壁中的纤维、半纤维素等与恿酮试剂发生反响而增加了测定误差。此外，不同的糖类与慈酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成

10、误差，但测定单一糖类时那么可防止此种误差。糖类与葱酮反响生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm,故在此波长下进行比色。【仪器与用具】同方法一。【试剂】1 .慈酮乙酸乙酯试剂：取分析纯慈酮1g,溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。2 .浓硫酸（比重）。【方法】1 .标准曲线的制作按方法一标准曲线的制作方法参加标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中参加慈酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温Imin,取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在63Onm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标

11、准曲线，并求出标准线性方程。2 .可溶性糖的提取同方法一第二步。3 .显色测定吸取样品提取液于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸储水，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。4 .计算可溶性糖的含量，计算公式同方法一。三、3,5-二硝基水杨酸比色法测定复原糖【原理】5 ,5-二硝基水杨酸溶液与复原糖（各种单糖和麦芽糖）溶液共热后被复原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，复原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系。在540nm波长下测定棕红色物质的消光度值，查标准曲线，便可求出样品中复原糖的含量。【仪器与用具】25ml血糖管或刻度试管；大离心管或玻璃漏斗；IOoml烧杯；100ml三角

12、瓶；100ml容量瓶；刻度吸管1ml、2ml、IOmh沸水浴；离心机（过滤法不用此设备）；电子天平；分光光度计。【试剂】（1） lmgml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80C烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸储水溶解后，定量转移到IoOml的容量瓶中，以蒸储水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。（2） 3,5-二硝基水杨酸试剂：6.3g3,5-二硝基水杨酸和262ml2molLNaOH溶液，力口到50OmI含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解。冷却后加蒸储水定容至100om1,贮于棕色瓶中备用。【方法】1 .制作葡萄糖标准曲线取7支具有

13、25ml刻度的血糖管或刻度试管，编号，按表242所示的量，精确参加浓度为lmgml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。将各管摇匀，在沸水浴中加热5min,取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸储水定容至25ml刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，那么向每管参加蒸储水，混匀）。在540nm波长下，用O号管调零，分别读取16号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖mg为横坐标，绘制标准曲线，求得直线方程。表24-2各试管加溶液和试剂的量管号0123456葡萄糖标准液(ml)0蒸馈水(ml)3,5-二硝基水杨酸试剂(ml)相当葡萄糖量(mg)02.样品中复原糖的测定(1)样

14、品中复原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在IOoml的烧杯中，先以少量蒸储水调成糊状，然后加50ml蒸偏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20min,使复原糖浸出。离心或过游，用20ml蒸储水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或涯液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸储水定容至刻度，混匀，作为复原糖待测液。(2)显色和比色：取3支25ml刻度试管，编号，分别参加复原糖待测液2ml,3,5二硝基水杨酸试剂，其余操作均与制作标准曲线相同，测定各管的消光值。分别在标准曲线上查出相应复原糖mg数，按下式计算复原糖百分含量：rL-X100复原糖()=xlOOO式中C-标准曲线方程求得的复原糖mg数

15、V一提取液的体积(ml)；a显色时吸取样品液体积(ml)；W一样品重(g)o四、淀粉含量的测定【原理】淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用苯酚或葱酮试剂与糠醛化合物的显色反响，即可进行比色测定。【仪器与用具】电子天平；容量瓶：10OmIX4,50ml2;漏斗；小试管假设干支；电炉；刻度吸管OSmlxL2.0ml3,5ml4;分光光度计；记号笔。【试剂】(1)浓硫酸(比重；(2) 4；(3) 2%慈酮试剂：同慈酮法(或9%苯酚，同方法一)；(4)淀粉标准液：准确称取100mg纯淀粉，放入IoOmI容量瓶中，加60

16、70ml热蒸储水，放入沸水浴中煮沸，冷却后加蒸储水稀释至刻度，那么每ml含淀粉Img,吸取此液，加蒸储水稀释至50ml,即为每ml含淀粉100Pg的标准液。【方法】1 .标准曲线制作取小试管11支从010编号，按表24-3参加溶液和蒸锚水。以下步骤按苯酚法或葱酮法均可，见方法或方法二，绘制相应的标准曲线。表24-3各试管参加标准液和蒸福水量管号01-2345678970淀粉标准液（ml）0蒸储水（ml）0淀粉含量（mg040801201602002 .样品提取将提取可溶性糖以后的残渣，移入50ml容量瓶中，加20ml热蒸储水，放入沸水浴中煮沸15min,再参加高氯酸2ml提取15min,冷却后

17、混匀，用滤纸过滤，并用蒸储水定容（或以25007min离心IOmin）。3 .测定可采用苯酚法或葱酮显色法测定。按下式计算淀粉的含量。淀粉水解时，在单糖残基上加了1分子水，因而计算时所得的糖量乘以才为扣除参加水量后的实际淀粉含量。勺TOO淀粉含量（）=叔10式中C一标准曲线查得的淀粉含量（g）;V一提取液总量（ml）；a显色时取液量（ml）；W一样品重（g）o注：淀粉水解完全度试验样品测定中可同时作1份用于淀粉水解完全度检验的样品，在酸解过滤后,将其残渣加上2ml水，搅拌均匀，吸2滴于白瓷盘上，力口2滴I2-KI溶液，显微镜下观察，假设出现紫蓝色颗粒，证明水解不完全，其正式测试样品需再加高氯酸水解，直至不出现蓝紫色为止。【思考题】1 .简述苯酚法与慈酮法测定可溶性糖的根本原理。2 .干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些？怎样防止？