全血DNA的提取及电泳.ppt

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1、全血DNA的提取及电泳晁耐霞2013.03.301.实 验 原 理DNA一、全血DNA的提取由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与而与白细胞相分离白细胞相分离。通过通过SDS的的破膜破膜（细胞膜和核膜）作用，使白（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出细胞释放出DNA。然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质去除蛋白质。最后用乙醇最后用乙醇沉淀洗出沉淀洗出DNA。2.材料与方法.材料材料用含抗凝剂的采血管进行采血，抗凝剂一般用含抗凝剂的采血管进

2、行采血，抗凝剂一般有有EDTAEDTA和肝素，和肝素，EDTAEDTA更好一些，不会影响下更好一些，不会影响下游的反应。游的反应。每每5ml5ml的血液中加入的血液中加入0.4ml 0.04M EDTA0.4ml 0.04M EDTA配好的配好的EDTAEDTA溶液，颠倒混匀即可。溶液，颠倒混匀即可。保存于保存于-20-20至至-80-80，最好在，最好在2 2个月内提取。个月内提取。3%明胶，明胶，TES，Tris饱和酚（饱和酚（pH7.8），），氯仿：异戊醇（氯仿：异戊醇（24:1），无水乙醇，），无水乙醇，TE离心机，离心机，7ml离心管，离心管，1.5mlEP管，中试管，管，中试管，移

3、液器移液器方法：提取WBC取1ml 全血等体积3%明胶37静置，510min取上清3000r/min 离心，5min弃上清颠倒混匀溶液颜色均一溶液颜色上下分层沉淀颜色为红色 破碎WBC加入2ml TES加10滴10%SDS轻轻敲击管底震荡混匀颠倒混匀溶液全部变为粉红色溶液颜色变暗 抽提DNA加等体加等体积Tris饱和酚和酚颠倒混匀，50次，3000rpm，离心5min取下层酚溶液，混匀后溶液变为均一的棕色取上清取上清加等体加等体积氯仿：氯仿：异戊醇异戊醇（24:1）将上清移入将上清移入试管试管颠倒混匀，50次3000rpm，离心5min混匀后溶液变为均一的乳白色上清夜（DNA）蛋白质层酚溶液上

4、清夜（DNA）蛋白质层氯仿溶液 沉淀DNA加2.5倍无水乙醇吸出絮状沉淀到1.5mlEP管挥干至无色液体通风橱内放置5min加入100 ddH2O溶解缓慢加入后，上下均为无色，但有分层面；吸取上层乙醇，轻轻吹打下层（油状）混匀。无水乙醇与水溶液交界面特点：1.气泡 2.白色絮状沉淀二、琼脂糖凝胶电泳二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定以及纯化DNA或者RNA分子的方法。这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。1.原理电泳介质 琼脂糖是一种天然聚合脂糖是一种天然聚合长链状分子，是由状分子，是由D型和型和L型半乳糖以型

5、半乳糖以-1，3和和-1，4糖苷糖苷键相相连形形成的成的线状高状高聚物。聚物。沸水中溶解，沸水中溶解，45 开始形成多孔性开始形成多孔性刚性性滤孔，孔，凝胶孔径的大小（凝胶孔径的大小（孔径范孔径范围从从50nm到大于到大于200nm）决定）决定于于琼脂糖的脂糖的浓度。度。.DNA分子的电荷效应：a)DNA在高于其等在高于其等电点的溶液中点的溶液中带负电，在，在电场中向阳极移中向阳极移动。b)DNA带净电荷量的多少与荷量的多少与电流流强度度，电泳泳缓冲液的冲液的pH值和和离子离子强度度有关有关。.DNA琼脂糖电泳的分子筛效应：在一定的在一定的电场强度下，度下，DNADNA分子的迁移速度取决于分分

6、子的迁移速度取决于分子子筛效效应，即，即分子本身的大小分子本身的大小、构型构型和和琼脂糖的脂糖的浓度度是主要的影响因素。是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。分子的迁移速度与其相对分子量成反比。M 1 2 3 4 5琼脂糖脂糖的的浓度度示踪染料：示踪染料：有致癌性有致癌性:EB，吖啶橙等橙等;无毒的染料：无毒的染料：goldview I核酸染料等核酸染料等.示踪染料和分子量示踪染料和分子量标准参照物准参照物EBgoldview 分子量分子量标准参照物（准参照物（Marker）实验材料：材料：全血基因全血基因组总DNA.实验试剂：琼脂糖脂糖5TAE电泳泳缓冲液冲液6电泳泳载

7、样缓冲液（冲液（6 loading dye）：）：0.25 溴溴酚酚蓝，0.25%二二甲甲苯苯青青，40(w/v)蔗糖水溶液，蔗糖水溶液，贮存于存于 4。goldview I型核酸染料：型核酸染料：每每10 l DNA加入加入2 l染料。染料。3.3.实验材料和试剂实验材料和试剂.实验仪器器凝胶成像系统凝胶成像系统4.操作步骤.制胶制胶 1.0%1.0%琼脂糖凝胶，脂糖凝胶，0.50.5TBETBE.上上样 上上样缓冲液冲液.电泳泳 100V100V，20min20min.观察察 紫外灯下紫外灯下观察察溶溶 胶胶上样准备DNA:8l6loading dye:2lTotal:10l 分别吸取上述

8、体积的DNA和6loading dye，至透明胶布的光滑表面，用移液器吹打均一。凝胶冷却至凝胶冷却至50，加，加goldview I 2 l摇匀匀凝胶凝固后取出梳子凝胶凝固后取出梳子加加缓冲液冲液准准备样品品点点 样电 泳泳注意注意观察溴酚察溴酚蓝染液的迁移染液的迁移紫外灯下紫外灯下观察察电泳泳结果果照照 相相1.1.制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀；制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀；速度也不可太快，否则容易出现气泡。速度也不可太快，否则容易出现气泡。2.2.2.2.胶胶一一定定要要凝凝固固好好才才能能拔拔梳梳子子，方方向向一一定定要要竖竖直直向向上上，不要弄坏点样孔。不要弄坏点样孔。3.3.3.3.点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多要太多。实验注意事项