小鼠黑质多巴胺能神经元的研究.docx

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1、小鼠黑质多巴胺能神经元的研究小鼠黑质多巴胺能神经元的研究 2018/12/24 目的:探讨趋化因子CCL2(ChemokineC-CmotifLigand2)对小鼠黑质多巴胺能神经元的损伤。方法:将CCL2单次注射入C57BL/6J小鼠黑质部位，在注射前和注射后的各个时间点分别记录小鼠的行为轨迹，并将注射后不同时间点的小鼠灌注固定取脑，通过免疫组织化学方法检测黑质多巴胺能神经元的数量变化。结果:免疫组化检测显示在CCL2注射后21d开始黑质多巴胺能神经元的数量明显减少，并显著低于对照组，一直持续到注射后28d;并且在注射后28d时小鼠的运动速度显著低于对照组。结论:脑内注射CCL2可以损伤小鼠

2、黑质多巴胺能神经元。趋化因子CCL2;黑质;多巴胺能神经元;小鼠帕金森病(Parkinsonsdisease，PD)是常见、多发的与年龄相关的一种神经变性疾病，PD的主要病理表现为黑质(substantianigra，SN)多巴胺(dopa-mine，DA)能神经元的变性减少1。尽管认识到DA能神经元缺失这一主要神经改变是PD发病的根本已有数十年之久，但对其确切病因尚没有满意答案。近年来人们发现，脑内炎症在PD的发病过程中具有重要作用:尸检分析发现PD病人黑质纹状体系统中有小胶质细胞的增加和激活，小胶质细胞分泌的促炎因子如TNF-、IL-1、IL-6和TGF2等明显增高2，3。CCL2(Che

3、mokine(C-CMotif)Lig-and2)又称MonocyteChemoattractantProtein1(MCP-1)，是CC族趋化因子成员之一，是由炎症信号诱导分泌的一种典型的趋化因子4。在中枢神经系统，星形胶质细胞和小胶质细胞都是CCL2的主要来源，在小胶质细胞上有CCL2的特异性受体CC25。有研究发现，CCL2可以招募并激活小胶质细胞，表现出吞噬功能并释放大量的自由基、细胞毒性细胞因子等6，有文献报道，PD患者外周单核细胞CCL2表达增加，PD病人脑脊液中CCL2的浓度和PD一些症状的严重程度呈正相关7。那么CCL2在PD的发病过程中究竟有什么作用呢，目前为止还未见报道。本

4、文将探讨黑质内注射CCL2是否能够损伤黑质多巴胺能神经元并引起相应的行为学改变，以期揭示黑质多巴胺能神经元损伤的部分机制。材料和方法1材料11动物本研究所用动物为8周雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，由首都医科大学实验动物部提供。饲养条件为SPF级，动物处于每天12h光照与12h黑暗交替环境，自由饮水摄食。12主要试剂小鼠重组CCL2(Sigma美国)溶于高压灭菌的001mol/LPBS中，终浓度为50ng/l，所用抗体为小鼠抗TH抗体(Sigma美国)。2方法21小鼠黑质立体定位注射小鼠称重，用6%水合氯醛按6ml/kg体重腹腔注射麻醉。将麻醉好的小鼠固定于脑立体定位仪(DavidKopF

5、美国)上，头部备皮，并用常规碘酒和酒精消毒，取正中矢状切口，切开皮肤及皮下组织，钝性分离，直至暴露颅骨。根据GeorgePaxinos第二版小鼠脑立体定位图谱确定黑质注射位点坐标。选择的注射位点坐标为:前囟后()300mm，正中线旁开(L)11mm，硬脑膜下(V)45mm。用牙科钻于相应颅骨处钻开一小孔，用针头挑破并去除小孔处的脑膜。用Hamilton微量注射器分别将500ngCCL2(实验组)或者相同体积的无菌001mol/LPBS(对照组)于上述注射位点按1l/min的速度缓慢匀速地注射到小鼠黑质部位，注射完毕后留针10min，以防止液体溢出，然后缓缓退出Hamilton微量注射器。缝合皮

6、肤切口，并用碘酒和酒精消毒，将动物放置于温暖的环境中，待其苏醒后给予食水。取注射后7d、14d、21d和28d4个时间点进行检测，每个时间点取8只动物，总计64只动物。22小鼠行为学分析分别于给药前(0d)和给药后(7d、14d、21d和28d)记录小鼠行为轨迹。将小鼠放置于相同的无盖盒内(长30cm，宽20cm)，5min后用SONY数码摄影机从盒子上方记录小鼠行为运动15min，记录均在上午10点进行。采用实验动物行为轨迹分析软件(EthoVision，Version80)计算小鼠每5min在盒内的平均运动速度(cm/s)和运动距离(cm)，图像采集6帧/秒。23灌注取材不同时间点的小鼠在

7、做过行为学测试后进行灌注固定，用6%水合氯醛腹腔注射麻醉，按6ml/kg剂量给药，待小鼠进入深度麻醉，将小鼠腹面朝上妥善固定于蜡盘上，充分暴露心脏。先灌注09%生理盐水，将血液冲干净后再灌注含4%的多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB)。灌注完毕后，用咬骨钳剥离颅骨及硬脑膜取出脑，放入上述相同的固定溶液中继续后固定4h，然后将脑组织放入含30%蔗糖的PB溶液中脱水，脑组织均4保存，待其完全沉底后即可进行冰冻冠状切片，切片厚为40m，每6张取一张。24免疫组织化学染色切片入3%H2O2中10min以清除内源性过氧化物酶的活性，切片入001mol/LPBS清洗3次，10min/次，切片入封闭液(含5%羊血清

8、和001%TritonX-100)封闭1h，以上过程均在室温下进行。切片在一抗(小鼠抗TH抗体，15000)中4过夜，再入生物素标记的二抗(羊抗小鼠IgG，1300)室温孵育2h，切片入HP标记的链酶卵白素(1300)室温孵育2h;以上每个步骤结束后切片均入001mol/LPBS室温漂洗3次，10min/次。DAB显色液孵育显色，控制显色程度，转入001mol/LPBS终止反应。切片入001mol/LPBS中裱片，自然干燥，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片;显微镜下观察并拍照。25体式学计数使用Leica普光显微镜结合MBF体视学计数系统及其SteroInvestigator(Version

9、8)软件对SN的DA能神经元进行计数。在SN区所有连续切片中每6张取1张作为计数样本。统计学处理:应用SPSS160统计软件包，所得数据均以x珋s表示。组间比较以t检验判断，P005为差异有统计学意义。结果1小鼠运动速度改变为了从行为学角度观察CCL2处理是否能对黒质造成影响，我们使用检测动物行为学改变的经典方法旷场实验来研究小鼠的运动速度是否有改变。实验组(CCL2)和对照组(PBS)在注射前0d及注射后7d、14d、21d、28d于相同环境中检测，结果显示:实验组(CCL2)在所有时间点内呈整体下降的趋势，表现出运动迟缓、不爱活动，对旷场的探索行为减少。注射后28d时实验组(CCL2)小鼠

10、5min内平均运动速度明显低于对照组，降低了379%(P=00087)，其它时间点则无统计学意义(Fig1)2CCL2对黒质DA能神经元有损伤作用注射后7d和14d时实验组和对照组相比黒质TH阳性神经元形态、数量差异不明显;注射后21d时实验组与对照组相比可见TH阳性神经元数量与对照组相比减少了252%，有显著性差异(P=0035)、染色变浅、纤维减少;而注射后28d时，实验组TH阳性神经元数量与对照组相比减少的更为明显，减少了454%(P=00049，Fig2)讨论本研究通过立体定位方法直接注射趋化因子CCL2到小鼠黒质，通过多个时间点的检测，观察到小鼠在给药后28d开始行为学发生异常改变，

11、包括运动速度的减慢，同时免疫组织化学染色和体视学计数方法发现小鼠黒质致密部的DA能神经元损伤并减少，说明CCL2本身就可以损伤黒质DA能神经元。同时，我们的研究也观察到，DA能神经元丢失是逐步的，是随着CCL2注射时间推移而增加的，当丢失到达一定程度时才对小鼠的行为造成影响，出现PD样表现，这提示CCL2对神经元的损伤具有“进行性”的特点，而这些正是PD病程的关键特征，因此CCL2也可用于帕金森病模型的制作。本研究观察到的这种CCL2对黑质DA能神经元进行性损伤可能与小胶质细胞有关联。近年来帕金森病与神经炎症相关的观点日益受到人们的重视8，目前已经知道，介导脑内炎症的主要是小胶质细胞和星形胶质

12、细胞。其中小胶质细胞是中枢神经系统内的免疫感受与效应细胞，生理情况下，小胶质细胞起着清除代谢产物、维护组织稳定的作用9。当脑组织受到感染、外伤、缺血或毒性物质侵害时，小胶质细胞即被活化，通过释放多种生物活性物质来发挥多方面的作用，包括促进炎症及抑制炎症的双向复杂作用10。CCL2的特异性受体CC2在中枢神经系统主要表达在胶质细胞上，CCL2通过与之相结合在小胶质细胞的募集和炎症扩散上起作用11，12，CCL2可能募集更多的小胶质细胞到黑质从而损伤黑质多巴胺能神经元。以往的研究表明，黑质DA能神经元表达CCL2和其受体CC213，14，黑质内注射CCL2(50ng)可增加DA能神经元的兴奋性，导致DA能神经元迅速释放DA15，本实验所注射的CCL2的计量为500ng，可导致DA能神经元更为长久剧烈的兴奋性和DA的释放，也可能是DA能神经元损伤并减少的因素之一。