毛细管电泳PPT课件.ppt

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1、第十二章毛细管电泳分析法第一节第一节 概述概述 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径玻璃毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳高效毛细管电泳。在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1983年H.Jerten把凝胶电泳引入到毛细管电泳中。1984年Terabe等把胶束电泳技术引入到毛细管电泳中，为今后发展新型的毛细管电泳分离模式提供了依

2、据。1989年在胶束电动毛细管色谱模式的体系中，加入手性拆分试剂，实现了对映体的拆分。1988-89年,出现了第一批毛细管电泳的商品仪器。HPCE的优点：的优点：(1)分离效率高，毛细管中心与外界的距离很短，电泳产生的焦耳热很快被散去，有效防止电泳条带的扩散。(2)检测灵敏度高，以样品的绝对量表示。用激光诱导荧光检测器灵敏度可达10-19g (3)样品用量少 (4)仪器结构简单，操作方便，环境友好。第二节第二节 毛细管电泳的基本原理毛细管电泳的基本原理 一、电泳：指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度qE=fq离子所带的有效电荷；离子所带的有效电荷；E 电场强度；电场强度；离

3、子在电场中的迁移速度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数平动摩擦系数(对于球形离子：对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力离子的表观液态动力学半径；学半径；介质的粘度；介质的粘度；)溶质在给定的缓冲液溶质在给定的缓冲液中，单位时间在单位中，单位时间在单位电场下移动的距离电场下移动的距离二、电渗现象与电渗流二、电渗现象与电渗流1.1.电渗流现象电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。固界面形

4、成双电层，二者之间存在电位差。当当液液体体两两端端施施加加电电压压时时，就就会会发发生生液液体体相相对对于于固固体体表表面面的的移移动动，这这种种液液体体相相对对于于固固体体表表面面的的移移动动的的现现象象叫叫电电渗渗现现象象。电电渗渗现现象象中中整整体体移移动动着着的的液液体体叫叫电电渗渗流流（electroosmotic electroosmotic flow flow，简简称称EOFEOF）。）。EOFEOF=E/E/2.HPCE中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质3.HPCE中电渗流的流形4 4.HPCEHPCE中电渗流的作用中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离

5、子电泳速度的电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 57 7倍；倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流电渗流+ef +ef 阳离子运动方向与电渗流一致；阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流电渗流-ef -ef 阴离子运动方向与电渗流相反；阴离子运动方向与电渗流相反；0 0=电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致；（1 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率

6、和选择性，如同改变LCLC中中的流速；的流速；（3 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在在HPCEHPCE中，控制电渗流非常重要中，控制电渗流非常重要。三、三、HPCE中影响电渗流的因素中影响电渗流的因素1.1.电场强度的影响电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。作电压。2.2.毛细管材料的影响毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同。产生的电渗流大小不同。3.3.电解质溶

7、液性质的影响电解质溶液性质的影响（1 1）溶液）溶液pHpH的影响的影响（2 2）阴离子的影响）阴离子的影响 （3 3）离子强度的影响）离子强度的影响*4.4.温度的影响温度的影响 毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于温度变化来自于“焦耳热焦耳热”；温度每变化温度每变化1 1，将引起背景电解质溶液黏度，将引起背景电解质溶液黏度变化变化2%2%3%3%；5.5.添加剂的影响添加剂的影响（1 1）加入浓度较大的中性盐，如）加入浓度较大的中性盐，如K K2 2SOSO4 4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，溶液离子强度

8、增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。电渗流减小。（2 2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDSSDS），），可以使壁表面负电荷可以使壁表面负电荷增加，增加，zetazeta电势增大，电渗流增大；电势增大，电渗流增大；四、淌度四、淌度1.1.绝对淌度绝对淌度(absolute mobility)absolute mobility)abab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移

9、无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。速度，简称淌度。可在手册中查阅。2 2.表观淌度表观淌度 apap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：apap=ap ap E E五、五、HPCE中的参数与关系式中的参数与关系式1.迁移时间（保留时间）HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。2.分离效率（塔板数）在HPCE中，仅存在纵向扩散，2=2Dt 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。

10、由此可得某离子的由此可得某离子的表观趟度表观趟度3.3.分离度分离度 分离度可按谱图直接由下式计算：分离度可按谱图直接由下式计算：六、影响分离效率的因素六、影响分离效率的因素区带展宽区带展宽1.纵向扩散的影响 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响 当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降,实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。3.焦耳热与温度梯度的影响 散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：

11、1）减小毛细管内径；（2）控制散热；4.溶质与管壁间的相互作用 细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。第二节第二节 毛细管电泳仪毛细管电泳仪聚四氟乙烯聚四氟乙烯玻璃玻璃石英石英紫外、紫外、激光诱导荧光、激光诱导荧光、电化学（安培电化学（安培法）、法）、化学发光化学发光第三节第三节 分离模式分离模式n 毛细管区带电泳:(Capillary Zone Ele

12、ctrophoresis,CZE)n 毛细管凝胶电泳:(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)n 毛细管胶束电泳:(Micellar Electrokinetic Chromatography Capillary,MECC)n 毛细管聚焦电泳:(Capillary Isoelectric Focusing,CIEF)n 其他 毛细管区带电泳 带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。电泳和电渗流速度的矢量和。正离子正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子中性粒子：无电泳现象，受电渗流影

13、响，在阳离子后流出；：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子阴离子：两种效应的运动方向相反；：两种效应的运动方向相反；电渗流电渗流 电泳时电泳时,阴离阴离子在负极最后流出。子在负极最后流出。最基本分离模式，分离是基于样品中各个组分间质荷比的差异离子分析离子分析阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；阴离子分析阴离子分析加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；手性化合物分析手性化合物分析 加入手性选择剂，形成配合物的稳定

14、常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）毛细管凝胶电泳应用了凝胶，粘度大，抗对流性好，并能减小溶质扩散。交联和非交联（线性）的聚丙烯酰胺凝胶。具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。应用于蛋白质和核酸等生物大分子的分离 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（多用缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（多用SDSSDS），其浓度

15、其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。胶束电动毛细管色谱负电胶束以较慢的速度向负极移动中性分子在胶束相和溶液（水中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间与胶束结合的较牢，流出时间长；长；Analytical Chemistry,Vol.81,No.3,February 1,2009指数富集配体系统进化指数富集配体系统进化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术技术 J.AM

16、CHEM.SOC.2009,131,69446945 1.1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6 68 8V V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pHpH梯度；梯度；3.3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pHpH有关，有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；电中性，淌度为零；毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦蛋白质分析蛋白质分析