花序浸染法转化拟南芥.docx

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1、花序浸染法转化拟南芥花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。营养土和蛭石1：1比例混合。2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。不管你采取哪种方法，在种下拟南

2、芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。总之盖膜时间自己灵活掌握。3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇810小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌810小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最

3、好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。要转的每个基因的每个载体都是先2ml少量摇菌，然后按1：1

4、00的比例200ml大量摇菌。4 在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。在用花序侵染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果（因为这些角果将来结的种子肯定是非转基因的，如果不剪掉的话会降低阳性率，本身阳性率已经很低了，再降低就更不爽了），把100ml的5的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵染2分钟，侵染的过程要转动钵子，（侵染之前一晚上最好给钵子里浇些水，这样第二天侵染后钵子里的土就不容易掉出来），侵染后用滤纸擦干，侵染后的拟南芥要用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时。侵染后悉心照料，保持水分

5、充足。由于拟南芥的盛花期较长，所以一般要侵染23次。5 角果自然开裂后就可以收种子了。此时收的种子是T1种子。6 接下来就是筛拟南芥种子了，巴氏消毒液和灭过菌的ddH2O按1：1混合，在2ml离心管中灭菌就行，灭菌3次，总时间不要超过8分钟，用灭菌水洗5次。然后用灭过菌的0.1琼脂悬浮。用拟南芥筛选培养基进行筛选，加千分之一的卡那（Kana 母液100mg/ml,300ul母液/500ml MS）和头孢（cef 母液1 00mg/ml, 500ul母液/500ml MS）（1L8克琼脂），加卡那是由于TDNA标签上的NPT是卡那抗性的，起筛选作用；加头孢主要是抑菌作用。由于T1种子的阳性率较低

6、所以筛选时每个皿要筛很多种子，这时候种子之间可以紧密靠近，但注意不要过分紧密。有时候一个皿可以得到好几个阳性苗子，有时候一个都得不到，这个跟你转的基因以及转化效率有关。筛选TI种子的皿放在光照培养室，待这批种子长出拟南芥幼苗后就可以观察出来筛选效果，阳性的长的比较绿，而且比阴性的长的高一点，阴性的长的发黄，而且长的比较矮。T1阳性拟南芥幼苗至少20颗，挑选出阳性的拟南芥幼苗平铺于新的拟南芥筛选培养基让它长根，皿要立起来放。7 待拟南芥幼苗的根长到一定长度后就可以进行移栽了，移栽的过程中要清洗掉根部所粘的培养基，因为根部粘有培养基的话容易长菌，还有就是移栽时防止伤根。移栽完成后浇水并覆盖白色薄

7、膜34天。待角果开裂就可以收种子了，此时收的种子是T2种子，T2种子就已经开始出现分离比了，所以此时再进行筛选时每个皿里涂的种子就不宜过多了，种子之间不能靠的太近。如果是单拷贝的，则会出现3：1的分离比，如果是双拷贝的，则会出现15：1的分离比，依次类推。听他们说转拟南芥单拷贝出现的几率比转棉花要高。T2拟南芥幼苗挑1520颗。以单拷贝为例，即使是阳性的，也会出现AA和Aa两种情况，所以T2幼苗继续按上述方法让它长根，移栽，收种子，此时收的种子就是T3种子，继续筛选，如果T3不分离的话，那么证明是T2是AA；如果出现3：1分离比的话，那么T2是Aa。不出现分离的T2及T3种子就是纯系了，把它们种下去长出的拟南芥就可以进行基因功能验证了。最终要保证转基因纯系在10个以上。