输血科抗体效价测定操作规程.docx

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1、输血科抗体效价测定操作规程1、目的：规范实验室工作人员及学员的操作程序，确保实验过程及结果的准确性与可靠性。2、范围：本规程适用于本实验室抗体效价试验操作。3、职责3.1工作人员对所进行的抗体效价试验技术操作应熟悉掌握。4、程序4.1基本原理血型效价测定(又称效价滴定)是一种半定量方法，用来确定血清中抗体的浓度或比较红细胞表面抗原表达强度差异。血型抗体效价测定常用于以下情况4.Ll产前检查。测定孕妇体内同种免疫性抗体活性，以判断能否对胎儿造成危害，何时对胎儿状况进行更复杂深入的调查。4.1.2抗体鉴定：阐明自身抗体特异性。4. 1.3鉴别高效价、低亲合力抗体,KnopsChidO/Rodger

2、s、Csa、JMH抗体常表现此特性。4.1 .4观察筑基试剂对抗体活性的影响，以判断免疫球蛋白的类型(IgG或IgM)O4.2 血型IgM抗体效价测定4.2.1材料1）待滴定的血清或血浆2）应用2%-5%表达相应抗原的红细胞生理盐水悬液。要进行对比试验时要始终使用相同的细胞悬液。3）生理盐水，作为主要的稀释液，（也可用白蛋白作稀释液）。4.2.2操作步骤1）根据血清稀释度标记10支试管（比如1：1、1:2等）01：1代表1体积未稀释血清；1：2代表1体积血清被稀释至2体积或在稀释液中有50%的血清溶液。2）除第1管（未稀释，1：1）外，每支试管中加1体积盐水。3）前两管（未稀释1：1和1：2）

3、中，各加1体积血清。4）用干净的吸管，混匀1：2中的液体数次，转移1体积至下一支试管（1：4）o5）重复相同的步骤，直至完成所有稀释，每次使用干净的吸管混匀并转移液体。从最后一管中吸出1体积稀释血清并留存，以备后续稀释使用。6）按稀释度标记10支试管。7）从每个稀释过的血清中转移2滴至对应标记的试管，每个稀释度使用一支独立的吸管。每管加2滴2%红细胞悬液。也可加试剂商提供的3%-4%的红细胞悬液1滴，但这种方法不够精确。8）充分混匀，置入离心机，900-100Og离心15秒，肉眼观察凝集结果。1 .3血型IgG抗体效价测定4 .3.1材料1）待滴定的血清或血浆2）应用2%-5%表达相应抗原的红

4、细胞生理盐水悬液。要进行对比试验时要始终使用相同的细胞悬液。3） 0.2molL2-筑基乙醇（2-Me）4）多价抗人球蛋白试剂5）生理盐水，作为主要的稀释液，（也可用白蛋白作稀释液）。4） 3.2操作步骤1）取试管1支，加入患者血清1体积，再加入0.2molL2-Mel体积混匀加塞，置入室温30分钟。2）根据血清稀释度标记10支试管（比如1：2、1:4等）。1：2代表1体积2-Me处理过的血清；3）除第1管（1：2）外，每支试管中加1体积盐水。4）前两管（L2和L4）中，各加1体积2-Me处理过的血清。5）用干净的吸管，混匀1：4中的液体数次，转移1体积至下一支试管（1：8）o6）重复相同的步

5、骤，直至完成所有稀释，每次使用干净的吸管混匀并转移液体。从最后一管中吸出1体积稀释血清并留存，以备后续稀释使用。7）按稀释度标记10支试管。8）从每个稀释过的血清中转移2滴至对应标记的试管，每个稀释度使用一支独立的吸管。每管加2滴2%红细胞悬液。也可加试剂商提供的3%-4%的红细胞悬液1滴，但这种方法不够精确。9）充分混匀，37恒温水浴箱孵育30分钟。10）取出试管用生理盐水洗涤3次后，每支试管中加入抗人球蛋白试剂1滴，置入离心机，900-1000g离心15秒，肉眼观察凝集结果。4.4 结果判断打分并记录。前带效应可能会造成稀释度低的血清反应比稀释度高的血清弱。如果要避免结果误读，最好先观察稀

6、释度最高的试管,依次判读，直至未稀释样本管。4.5 说明：4.5.1肉眼观察产生1+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。例如,效价为32而不是L32.如果最高稀释度的血清仍有凝集，则没有达到终点，仍需要继续稀释并检测。4.5.2在比较研究中，效价的显著性差别可表现在3管或更多的稀释度上，技术的不同以及遗传学的多样化会引起对单一一个稀释液,以不同方法检测时会获得不同的结果。如含有抗体的血清其真实效价为32,在重复试验中，反应终点也许出现在L32试管、L64试管或1：16试管中。4.5.3没有额外的对凝集强度的评估，仅效价会使人误解。所以根据凝集强度确定评分，将各管中评分相加，表示抗体的反应能力。这

7、是抗体反应半定量的检测方法。对不同的检测样本比较采用评分，如果总评分相差10或更多，则认为差别有意义。衣I表集制度与效价评分对应我凝集强度效价评分4123IO2*8!5W2O04.5.4高效价低亲合力抗体的效价通常大于64,而且大部分试管表现出一致的弱反应。表2显示了对3个血清样本检测所取得的结果，每个样本在1：256后都无凝集。评分的不同表明反应强度的不同。样本3的就是高效价低亲合力抗体的特性（比如说终点高达256,而评分却仅为35）0表9.2抗体效价终点及评价的举例样本血清稀释效价m1248163264128256512样强3+3+3+2+2+2+1+士士064(256)64本1度1010

8、108885320样本2强度4+4+4+3+3+2+2+1+土0128(256)801212121()1088530样本3强度1+1+1+1+士土08(256)35评分5555333330高效价低亲合力抗体的效价通常大于64,而且大部分试管表现出一致的弱反应。在对产前检查或对试剂的评估中，效价通常被认定是由反应强度为1+的血清的最高稀释液来确定的。这与滴定终点（括号内）大有不同，就像高效价低亲合力抗体反应特征一样，如样本3显示O注意：效价测定方法仅是半定量技术。所用技术的不同，在很大程度上可影响反应结果。应采取认真的态度以取得最为可靠的参考值。1认真的移液技术是非常重要的。每次移液后都要更换移

9、液管。2始终选择最适当孵育时间，孵育温度以及最佳离心力及离心时间。3检测细胞的寿命，表型及浓度都将影响结果。当比较几份不同的血清抗体效价时，应用同一献血员的血。如果不可能，就应该用相同表型的献血员的红细胞试剂检测。当用同一血清检测不同的红细胞样本时，所有的样本都应在同一条件下收集、保存，并在使用前稀释到同一浓度。4.5.5使用大体积的检测比使用小体积的检测方法准确性高。同一组试验中，大量稀释得到的结果比每个实验分别稀释的结果更可靠。要计算所有试验需要的体积。每个稀释度都要准备足够的量。D1份血清多种特异性抗体效价测定法：多特异性的血清抗体当1份标本中含有几种特异性抗体，并且它们各自的效价要做比

10、较时,大体积统一倍比地稀释该血清（统一管）要比每种检测标本细胞都各自独立地准备血清的试验结果更准确。2）大体积统一倍比稀释血清（统一管）（1）试管架放12只试管，并根据血清稀释度做标记，如1：1到1：1024,第12管作为阴性对照（稀释液）。（2）在2-12管中加1体积生理盐水（或3%VV的用缓冲盐水稀释的牛血清白蛋白液），加入稀释液的体积取决于针对被检血清稀释度的细胞数量和所采用的血清学技术。（3）在第1管和第2管中加入相等体积的实验血清。（4）混合第2管并取出1体积至下一个试管中，重复至第11管。每次移液都使用干净的滴管或移液尖头，能得到更准确的稀释度。（5）如果需要，从第11管取出1体积

11、移到另一标记好的试管中备用。4.5.6分别测定各种抗体效价1）在试管架上放上标记的试管数排，每排12只，排数取决血清标本中有多少种抗体需要检测。2）从第12管稀释液对照管中开始移取2-4体积统一管的稀释液至相应的试管中，移液的体积决定所用的检测技术。3）在对应的试管中加1体积3%的试验用红细胞悬液，轻轻振荡试管。然后根据所选的检测技术继续试验。4）从稀释液对照开始判读和记录每排的结果。注意：在监视一种免疫反应时，许多种抗体效价需有规律（定期的）检查。例如，对孕妇，一定要保留要测效价的血清标本。为了保证对所测抗体效价有效的进行比较，在随后试验的标本应与前面保留的样本同时进行检测。解释：最高血清稀释度的滴度终点定在“3”分或（1）反应管，抗体效价定为稀释度的倒数，如1：32等于效价为32.每一稀释度个体的反应强度应累加。得到总体的“效价分数”。结果：血清A的效价为32,评分50。在做比较的研究中，至少要有两个稀释度效价不同，或至少得到10分的差异，才能认为该结果有意义。