靶向二代测序在感染性疾病诊疗中的规范化应用专家共识2025.docx

《靶向二代测序在感染性疾病诊疗中的规范化应用专家共识2025.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《靶向二代测序在感染性疾病诊疗中的规范化应用专家共识2025.docx（16页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、靶向二代测序在感染性疾病诊疗中的规范化应用专家共识2025摘要感染性疾病的诊疗关键是早期、快速、准确发现病原微生物。靶向二代测序CtNGS)由于其技术优势和高检测性能，而越发受到临床的广泛关注和应用。然而，tNGS的临床规范化应用还尚未统一，导致应用场景、样本采集、实验室检测、临床解读、质量控制等方面参差不齐，限制了tNGS的合理应用。因此，中国医学装备协会检验医学分会组织专家制定该共识，以规范tNGS临床应用，发挥tNGS技术优势，为感染性疾病诊疗提供保障。感染性疾病是临床诊疗的痛点，尤其在急、危、重、特等感染人群中，快速精准的诊断是临床靶向治疗的可靠依据。目前，新发感染性疾病总体呈上升趋势

2、病原体也呈现多元化和复杂化。因此，早期、快速、准确诊断病原微生物种类，对临床合理使用抗微生物药物及改善患者预后具有重大意义。宏基因组二代测序Cmetagenomicnext-generationsequencing,mNGS),通过对样本DNA和/或RNA进行高通量测序，无偏倚地检测几千甚至上万种微生物(包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等)，但mNGS检测灵敏度极易受人源背景的干扰，如何提高潜在病原体有效数据比例成为确保检测灵敏度的关键。靶向二代测序(targetednext-generationsequencing,tNGS)通过前置捕获和富集特定病原体的核酸，再进行高通量测序和生物信息学分析

3、可有效提高病原体的数据量和占比，提高检测灵敏度。tNGS可同时靶向检测上百种病原体，相较于传统病原学检测方法具有更广的检测范围和更灵敏的检出率，相较于mNGS能降低测序量，降低检测成本，减轻医疗负担。tNGS可分为基于液相探针杂交捕获建库的靶向测序和基于超多重聚合酶链反应(POIymeraSechainreaction,PCR)扩增建库的靶向测序口。止匕外，在测序平台的选择上，也可以使用基于单分子纳米孔测序技术路线的靶向测序进行病原体的鉴定。目前，mNGS在病原诊断领域得到广泛应用，已有多篇专家共识-J，但tNGS在感染性疾病诊疗方面尚无明确的共识。为进一步规范tNGS在感染性疾病诊疗中的应

4、用，中国医学装备协会检验医学分会自2023年4月组织专家共同编写本共识，经多次开会研讨，形成29条专家共识，以期促进tNGS技术的规范应用及发展推广。本共识拟实施的主要目标人群为危急重症感染的患者，使用者主要包括临床、检验、微生物、感控及公共卫生部门人员等，应用环境聚焦于传统检测受限、病情复杂或需精准治疗的感染场景。共识制定工作组由来自国内外41家机构54位专家组成，包括执笔人、指导专家和讨论专家。共识由指导专家提出中心思想和主要框架，执笔人开展临床调研和文献检索，以targetednext-generationsequencing、metagenomicnext-generationsequ

5、encingsinfection、pathogendiagnosis为关键词，在PubmedSpringerProtocolsWebofScience中国知网、万方数据和维普资讯检测至2024年8月的中英文文献，去重并精读后纳入30篇文献，结合临床经验并整理信息，撰写了共识的主要内容。之后经多次研讨会和初稿会收集讨论专家的问题和修改意见，凝练形成多条专家共识；采取函审形式由所有的专家审阅，整合反馈意见完成修改；通过专题会和定稿会，90%以上专家同意的共识描述纳入终稿，完成靶向二代测序在感染性疾病诊疗中的规范化应用专家共识。该共识主要规范了tNGS和mNGS的区别、tNGS应用场景和优势、样本采

6、集规范、实验室检测、临床解读、质量控制，助力感染性疾病的诊疗和监测。一、tNGS和mNGS的比较tNGS和mNGS都是以高通量测序和生物信息学分析为基础，辅助诊断病原微生物的技术手段，但二者在检测范围、检测成本、检测性能等方面存在差异（表1）。表1INGS和mNGS的参数比较方法学mNGSINGS检测原理样本核酸提取后，进行文库构建和高通量测序.分析和鉴定样本中的微生物种类及其相对丰度,并筛选与感染相关的病原体皿多重PCR路线:样本核酸提取后,采用多重/超多重PCR对临床关注的病原体进行靶向扩增、文库构建和高通量测序,分析和鉴定检测范围内的病原体g探针捕获路线:样本核酸提取后,构建宏基因组文库

7、并采用探针捕获技术针对性地捕获和富集文库中的靶标病原体,进行高通测序和病原体的鉴定靶向性非靶向靶向测序数据量较高,一般20Oooooo（20M）序列或以上川较低,一般100OoO(0.1M)序列3OOoOOo(3M)序列LW生信分析难度较斛相对较低B检测范围覆盖病原体可大于100oo种,214可检测罕见和新发病原体一般检测数卜种至数百种病原体（多重/超多重PCR技术路线）；或数卜种至上千种病原体（探针捕获技术路线）23；无法检测罕见或新发病原体检测成本较高较低（多重/超多重PCR技术路线）或中等（探针捕获技术路线）检测性能宿主背景较高时,检测灵敏度下降；耐药基因来源广、灵敏度较低,不适用于耐

8、药基因分析-M不受宿主基因组占比的影响（多重/超多重PCR技术路线）.或受宿主基因组占比的影响比宏基因组测序低（探针捕获技术路线0;耐药基因来源较明确、灵敏度较高,可用于耐药基因分析检测周期约为2438ht3*,6,7j约为1426h.注:tNGS为靶向二代测序,mNGS为宏基因组二代测序,PCR为聚合酶链反应共识1相对于mNGS,tNGS具有靶向性、测序数据量要求低、生信分析难度低、检测范围窄、检测成本低、灵敏度高、检测周期短的特点。二、tNGS的应用场景和优势90%以上mNGS阳性检出病原微生物种类不超过200种，而tNGS的检测范围主要针对常见、致病相对明确的100300种病原微生物,可

9、满足大部分感染性疾病诊疗需求。相较传统病原学检测（如涂片、培养、免疫学、PCR等），tNGS具有更广泛的检测范围和更高的检出率；相对于mNGS,tNGS成本较低，按需开展的同时可结合传统病原学检测，以获取更合理的诊断依据。对于危重症感染患者，传统病原学检测结果均阴性时，tNGS检测则显得非常重要。1 .血流感染：血流感染主要以全身性感染为主，病原体可随血液扩散，造成脏器功能损伤和病变，病情相对危重。与传统病原学检测相比，tNGS的检测灵敏度和准确性更高。但需注意的是tNGS检测的特异性低于传统病原学检测，对阳性结果的解读需紧密结合临床，以排除采样和检测过程中微生物的干扰。共识2疑似血流感染，建

10、议抗菌药物使用前、抗菌药物疗效差、停用抗菌药物24h后或下次用药前同步送检tNGS和血培养。2 .呼吸系统感染：呼吸系统感染的病原体更为复杂，病毒感染、变异和播散范围广，且容易引起细菌和真菌的继发感染，培养等病原学检测病毒和特殊病原体感染的局限性较大.。共识3疑似呼吸系统感染，常规用药效果不佳，3d内病原学检测阴性或重症感染时，推荐送检tNGS。共识4疑似tNGS检测范围内特殊病原体感染（如螺旋体、军团菌、支原体、衣原体、分枝杆菌等）且病情进展快或病程长的患者,免疫抑制、合并基础疾病、反复呼吸系统感染等病情危重者，有临床症状、影像表现或者血清学表现但规范抗感染治疗无效者，推荐送检tNGSo共识

11、5疑似罕见或新发病原感染，不在tNGS检测范围内，推荐mNGS检测。无法获得优质样本时，不建议送检硒GS或tNGS。3 .泌尿系统感染：泌尿系统感染是病原体直接侵入尿路，并侵犯尿路黏膜或组织而引起损伤。尿常规、尿沉渣镜检、尿涂片、尿生化等检查结果提示泌尿系统感染，尿培养是首选方法。对于支原体、衣原体、淋病奈瑟菌、结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌、丝状真菌等培养困难或培养时间长的特殊病原体，尿培养通常为阴性，如有相关病史、高危暴露因素或既往阳性等，需优先考虑常规PCR或多重PCR。共识6疑似泌尿系统感染,推荐优先采用尿培养明确感染的病原体，当尿培养阴性或无法明确病原体时，如果有特殊病原体感染史或暴露

12、因素等，推荐采用靶向PCR；如果无病原体怀疑方向时，推荐送检尿tNGSo4 .中枢神经系统感染：中枢神经系统感染常病情危急，表现为发热、乏力、头痛、抽搐、呕吐、脑膜刺激征、意识障碍等症状，需首先完善脑脊液常规和病原学检测。共识7疑似中枢神经系统感染，若3d内未明确感染病原体且抗感染经验性治疗无效，推荐送检脑脊液tNGS。共识8疑似tNGS检测范围内特殊病原体（隐球菌、脑膜炎双球菌、结核分枝杆菌等）且病势迅疾或迁延感染患者，建议送检tNGSo5 .局灶性感染：局灶性感染指除血流、呼吸系统、泌尿系统、中枢神经系统感染外，以局部组织出现感染性症状如红、肿、热、痛、扪及波动感、有脓液渗出为表现的一类疾

13、病。如眼部感染伴随分泌物增多、疼痛、流泪、视物障碍等；骨关节感染伴皮温升高、肿痛、功能障碍等；皮肤软组织感染形成破溃、脓肿等。严重情况下可能出现非特异性表现或全身感染中毒症状。相对于传统培养，tNGS在局灶性感染的病原学检测敏感性更高o共识9疑似局灶性感染，3d内常规病原学检测阴性，经验性用药治疗效果不佳,或疑似检测范围内特殊病原体且病势迅疾或迁延者,推荐送检tNGSo6 .其他感染：以上未提及的样本来源，需完善相应的常规感染指标、微生物培养、PCR等再行考虑高通量测序。共识10疑似其他感染，无法明确感染源，或病情持续进展及抗感染治疗无效，推荐送检tNGSO对于复杂感染、多重感染需判断主要病原

14、体，以及明确急、危、重症患者感染源时，建议首选mNGS。三、样本采集规范tNGS检测样本应根据患者情况，选择与病灶最为相关的部位进行采样送检。若样本采集困难且无法获得优质样本，病情不能耐受有创操作，或暂无明确感染部位的患者，可选择患者血液样本送检，但其检测准确性和阳性率可能低于病灶部位样本。所有样本采集应严格执行无菌操作，同时尽量在抗微生物药物首次或下一次使用前采集标本，及时送检。止匕外，无菌操作仍有可能引入其他非目标微生物的核酸，尤其是采样部位的定植微生物。为保障检测质量，需根据感染类型规范送检。共识11根据不同感染类型，推荐不同样本类型和采集容器，并按不同的采集时机、采集要点、样本量要求、

15、保存和运输条件规范送检，样本采集规范参考宏基因组检测或常规微生物采集要求。四、实验室检测7 .标本前处理：不同样本类型的前处理操作不同。对于咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、尿液、组织等样本，前处理主要涉及分装、破壁、离心、研磨、液化及消化等步骤。大多数细菌和所有的真菌都有细胞壁，需要破壁释放内部核酸，目前常用的破壁方式有机械研磨、化学酶处理和超声波破碎等。其中对于组织样本，需要研磨、切碎、胰酶消化；对于黏性较高的痰液等样本，需要进行液化处理，同时需注意在提取前样本已完全消化或液化，避免取样异质性对检测的影响。对于血液样本，需考虑血液样本不同成分对不同技术路线检测灵敏度的影响。研究表明，基于探针捕获技

16、术路线的血浆样本检测，其灵敏度高于血细胞或全血；对于超多重PCR建库路线，血细胞或全血的检测灵敏度高于血浆。因此应基于所选择的技术路线进行血液样本的离心分离和成分选择。区别于mNGS,tNGS为正向捕获技术，人源基因组对检测的影响较小，一般无需对黏稠样本、组织样本等高宿主背景的样本进行人源细胞裂解及核酸消化等去宿主处理。共识12tNGS样本提取前需进行合适的前处理（如黏稠样本的完全消化或液化,以及血液样本的血浆分离等）,一般无需去宿主核酸。8 .核酸提取：首先要验证所选的核酸提取试剂盒，确保核酸提取的质量及效率。每次提取的核酸样本均需记录浓度、纯度和完整性,确保核酸质量符合建库要求。提取过程中

17、应严格遵循无菌流程，每个实验批次中都应设有内参、阴性质控品和阳性质控品，以评估每批次核酸质量的可信度及实验室环境潜在的背景干扰。由于核酸提取效率对检测结果准确性的影响较大，对于核酸提取浓度较低的样本，tNGS检测灵敏度可能会下降，建议通过分析样本核酸提取浓度对检测灵敏度的影响，建立核酸提取的阈值，对于核酸提取浓度异常的样本，优先重新提取或重采样检测。止匕外，对于样本性状较为澄清的肺泡灌洗液、胸腔/腹腔积液等，可通过离心富集进行核酸提取的方式，提高对结核分枝杆菌、隐球菌等核酸提取效率较低病原体的检测性能。共识13提取样本核酸的质量控制是保障tNGS结果准确的前提。9 .文库构建：由于检测病原体类

18、型、物种报告范围、技术路线（超多重PCR或探针捕获）等存在较大差异，因此存在多种建库路线。临床通常多为病原体DNA和RNA共同检测,一般有3种不同的建库路线:（1）对提取的总核酸直接逆转录处理后进行建库；（2）分别提取基因组DNA和RNA,RNA逆转录后，再等比混合基因组DNA和互补DNA进行文库构建；（3）分别对DNA和RNA单独建库，即一个样本构建两个文库。如仅需检测病原体DNA或仅需检测RNA,适用于第3种建库路线，单独建库。共识14文库构建是tNGS的核心内容,直接影响检测灵敏度和特异性，需根据检测目的选择合适的建库路线，并做好质量控制。文库构建的核心是超多重PCR扩增引物或捕获探针，

19、其目的是扩增或捕获目标病原体及耐药基因等。目标病原体的范围需根据不同感染类型的流行病学特点确定，可纳入大样本量培养等传统方法学阳性的物种，以及不同地域的病原谱研究相关的物种，并在大样本量mNGS数据（如ioOoo例以上）中进行验证，以确定检测范围可反映临床病原体感染的比例，病原体应满足以下筛选规则：（1）需要有人类感染报道或在特定部位有感染报道；（2）基因组清晰，至少有1个完整的基因组；（3）覆盖临床感染的比例295%。对于耐药基因的检测范围，建议纳入常见的、与表型相关性比较高，以及对临床用药有较高指导意义的基因。探针捕获和超多重PCR建库2种技术路线在引物设计或捕获探针设计的原则具有相同的原

20、则，也存在一定差异。2种路线均基于关注的分类水平（如种、属和复合群等）上筛选核心基因组区域，在核心基因组区域上筛选关注分类的特异区域（即捕获/扩增区域）。同时，对于探针捕获技术，也会考虑在细菌、真菌的核糖体16S,18S和转录间隔区等区域选择高变区附近的序列进行设计，通过捕获高变区进行物种鉴定。而对于超多重PCR建库技术，由于所筛选的区域更多考虑分类水平的保守性和特异性，因此主要考虑针对核心基因组进行引物设计，以提高在关注的种、属或复合群等分类水平上鉴定的准确性和特异性。为确保检测结果的特异性，降低非特异性捕获或扩增的影响，建议针对每个物种设计多个捕获区域或多个扩增区域。共识15捕获探针或超多

21、重PCR引物,建议至少设计3对或以上；对于致病性或常见感染的病原体，建议设计5对或以上。质控方面，选择高质量且稳定的建库试剂盒，并做好质控记录;同时严格遵守防污染流程，批次实验前后进行消杀，并定期进行实验室环境监控，降低气溶胶污染风险。止匕外，同一批检测需加入至少1个阴控样本进行环境背景监控，同时，建议在建库试剂盒可加入外源内标序列，和/或捕获/扩增内参序列的方式进行捕获或扩增效率的监测。10 上机测序：tNGS主要为边合成边测序，测序平台和检测试剂直接影响检测性能，测序需采用模拟样本或临床已知病原样本验证全流程。相较于mNGS,tNGS的病原体序列的占比显著提高，其中基于超多重PCR的tNG

22、S病原体占比往往在50%甚至90%以上，而基于探针捕获的tNGS其病原体序列占比相对mNGS也能提高约10倍，因此在同等灵敏度的情况下可极大降低tNGS数据量要求o测序数据量由tNGS扩增体系的质量、文库碱基平衡情况及检测预期性能等实际情况决定。止匕外，主流tNGS测序读长包括SE50（单端50bp测序）、SE75、SElOo等。由于读长越短，物种鉴定的准确性越低，对于基因组同源性较高的物种可能存在鉴定错误的可能，因此建议如采用50bp读长的测序策略，需充分验证对物种鉴定准确性的影响。共识16基于探针捕获的tNGS建议数据量在1OOO000（IM）序列以上，基于超多重PCR的tNGS最低数据量

23、建议在100000（0.1M）序列以上。11 生信分析：生物信息学分析是对测序原始数据进行分析处理的过程，包括原始数据质控、比对目标参考序列、目标微生物序列质控及归一化计数。搭建实验室分析流程时，需对分析流程进行性能验证，使用质控品或已知阴阳性样本进行模拟测试，以保证分析流程的准确性和可重复性。止匕外，生信分析输出应尽可能全面，必须含数据质控和物种注释信息，以满足临床报告判断。需要注意的是，由于tNGS是针对目标物种进行靶向检测的技术，检测范围一般不包括检测范围外的其他微生物，因此tNGS一般不对检出的物种在不同病原体类型中的相对丰度进行分析和报告；如对相对丰度进行分析和报告，需注意该分析所得

24、的丰度信息不能完全反映该物种在所有微生物中的占比情况。共识17tNGS数据比对范围应包括检测范围内所有病原体和人源基因组，原始数据应去除低质量数据（质量值20）、短序列数据（N碱基比例过高的序列（N碱基5%）、低质量和接头序列36bp）、舍弃去adapter及质量修剪后长度小于30bp的序列和低平均质量值序列（平均质量值30）24共识18生信分析输出，数据质控应包括：数据量（总序列数）、测序质量（Q30比例）、内参序列数；物种注释应包括：种/属水平的中文名和拉丁名、原始序列数、归一化序列数、覆盖度（探针捕获法）或扩增子数（超多重PCR法）、阴控数据及各物种批次检出情况。12 结果报告：目前尚无

25、统一的、公认的阳性判读标准25血，实验室可根据方法学建立时确认的阳性阈值确定原则，确立不同病原体阳性检出的阈值，并持续调整和优化。不同检测体系中微生物类型的检出可能存在差异，需分别建立阳性阈值，如可根据革兰阳性菌、革兰阴性菌、丝状真菌、酵母菌、DNA病毒、RNA病毒、寄生虫及特殊病原体分别确定阳性阈值。检测结果需首先排除背景微生物的影响，若出现大量杂而无明显优势的微生物时，应先考虑为污染。共识19检测值低于阳性阈值，不报告；检测值达到或高于阳性阈值，排除实验干扰后报告阳性；无法排除实验干扰应复测或重新采样送检，必要时进行第二种方法学的验证（实时荧光定量PCR等）；无法重新采样或无剩余样本,高致

26、病性病原体需结合临床表现后谨慎考虑是否报告，其他病原体可作为疑似背景（灰区）进行报告，以提供更多信息供临床参考；检出病原体同时存在关联的耐药基因，建议同时报告耐药基因信息。tNGS检出一定序列数的特定病原体（如共识4、共识810）,但低于阈值且属于背景水平，则无法与背景信号进行区分。灰区信号的样本，需结合临床信息进行解读，对于临床明确怀疑某特定的病原体感染时，建议在灰区检出后进行其他方法学验证或复检后报告。对于tNGS来说，由于文库构建的过程均涉及到通过PCR等进行靶标富集，同时，基于靶向捕获的tNGS检测，其文库构建也相对于mNGS更为复杂，因此tNGS检测受检测环境中微生物污染以及实验室气

27、溶胶污染的概率相对更高。因此在低序列数检出的情况下，难以排除来源于实验室污染或样本之间相互干扰的可能性。对于临床重点关注的致病性病原体（如结核分枝杆菌等），在一定的检测灰区建议采用其他方法学进行确认。共识20不同病原体在不同部位中检出的临床意义不同，建议根据微生物本身的致病性和样本来源，分为致病性微生物、条件致病性微生物及定植或微生态微生物进行分级报告。五、临床解读正式报告中，致病、条件致病和定植/微生态微生物是基于特定样本类型中病原体的致病性进行分级，具体是否为病原体，需综合临床情况进行判断。tNGS检出多种条件致病微生物，而传统微生物检测报告一种或多种提示某病原体时，其他条件致病微生物可考

28、虑为定植或微生态微生物。共识21致病性微生物，建议考虑为病原体。条件致病微生物，建议结合免疫状态、宿主因素、理化指标、影像特征、用药史、治疗效果、传统微生物检测结果等，综合判断是否为病原体。共识22定植或微生态微生物，一般不考虑为病原体；如为免疫抑制或与其他微生物检测结果一致或与临床诊断相符,建议作为病原体依据之一。mNGS报告的耐药基因来源广，灵敏度较低，一般无法定位到相应病原体。而tNGS是针对耐药基因片段设计引物或探针，靶向性强，耐药基因来源较明确，灵敏度高于11NGS,可用于耐药基因分析。致病菌耐药表型不仅受耐药基因的携带情况，也受耐药基因的表达和其他耐药因素影响，因此临床解读耐药基因

29、也需考虑耐药基因与耐药表型的一致性问题共识23耐药基因,建议主要关注临床常见导致耐药的调控基因。革兰阴性杆菌或肠杆菌科，建议关注头抱菌素耐药相关的blaCTX-M.blaSHVblaTEM等基因；碳青霉烯类耐药相关的blaNDM、blaKPCblaIMPblaVIM、blaOXA-23blaOXA-48blaOXA-51等基因；甲氧西林耐药相关的mecA等基因，万古霉素耐药相关的vanA.vanB.vanC等基因；大环内酯类耐药相关的核糖体23SrRNA基因突变；结核分枝杆菌一二线用药相关的基因突变及非结核分枝杆菌耐药相关的ermrrl等基因。tNGS检出致病或条件致病微生物与临床怀疑方向不一

30、致时，应根据tNGS检测结果重新进行临床评估。经过完善检测后仍不考虑的，条件致病微生物考虑定植，而致病微生物需实验室排除污染可能后再行评估。怀疑特定病原体而tNGS检测阴性时，需排除假阴性可能或灰区，可进行第二种方法学验证。六、质量控制1 .人员要求：检测全流程由不同职能的人员组成，负责样本核酸提取、文库构建、上机测序操作的“湿实验”操作人员应具备分子生物学检验专业技能；负责生物信息分析流程开发和维护（即“干实验”操作）的人员，应具备生物信息学研发和管理相关技能；报告解读团队，应具备临床感染病学、临床微生物检验学和/或分子生物学等专业背景，负责结果解读、审核和报告咨询，尤其是针对疑难病例某些特

31、定领域需获得国家要求的相应资质，如“湿实验”操作人员在上岗前应根据医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法的规定获得相应的资质。共识24实验室人员应根据岗位职责参加不同的培训，包括政策法规、质量管理体系、标准操作规程、性能确认、生物安全、仪器设备的使用和维护、室内质量控制、室间质量评价及其他专业知识，并留存培训记录。共识25检测全流程的管理，应制定相应的质量体系文件，及仪器、项目等标准操作流程(standardoperatingprocedure,SOP),形成质量手册，放于固定位置以备随时查阅，指导检测全流程质量控制。2.检验前中后的质量控制：采样前应填写知情同意书，采样后填写样本送检申请单，

32、应确保申请单包含必要的信息(如患者姓名、性别等基本信息，样本类型、采样部位、采样时间等样本信息，以及诊断方向、感染指标及其他实验室检查结果、抗微生物药物种类及用药时长等临床信息)。应明确样本接收标准和拒收标准，可同时设置让步检测的样本标准。若让步检测，需及时与临床沟通，确认后再进行让步检测。共识26检验前质量控制，建议包含知情同意书、送检申请单、接收标准、拒收标准、让步检验标准。共识27检验中质量控制，建议遵循基因扩增实验室标准要求，合理规划分区并制定详尽的全流程检测SOP及异常情况处理程序。全流程检测SOP应包括实验检测（样本前处理、核酸提取、文库构建、上机测序）、生物信息学分析，当质量控制

33、指标发生异常时,应按异常情况处理程序进行分类处理，如重新采样、重新检测、让步检测、结果验证后发放报告等。共识28检验后质量控制，建议建立结果报告流程，剩余样本保存规定及实验室环境管理规定。tNGS的结果报告需建立适当的流程，包括解读者和审核者双人复核机制；对于特殊样本或罕见病原体检出，需进行实验、生信、临床解读等多学科讨论；对于高致病性病原微生物，应按照法定流程进行结果上报，并及时对生物样本进行无害化处理。剩余样本的保存可确保检测结果异常或其他需要进行结果复核时，可重新进行核酸提取和tNGS检测。剩余样本应统一分装至标准保存容器，进行低温冷冻保存，建议保存期限2周，并在保存期满后，无论检出情况

34、如何均需按感染性医疗废物统一处理。实验室应定期进行环境检测、评估与消杀，每次实验前后都需要对实验室进行清洁消杀，对环境背景监控异常区域应进行重点清洁与消杀，防止气溶胶等污染。共识29tNGS检测应对“干实验”及其全流程进行适当的性能确认。“干实验”的性能确认包括对计算机模拟测序数据的分析：利用序列模拟软件模拟生成覆盖所有检测范围内物种的测序数据集，数据应与真实测序数据具有相同/相似的技术参数，并采用相同流程分析临床样本，确认生信分析可准确鉴定检测范围的所有物种。全流程的性能确认包括精密度、检出限、交叉反应、方法学符合率、干扰物质以及试剂稳定性等E2829O七、局限性1 .检测范围难以标准化：目

35、前tNGS的检测和报告范围没有统一,各检测试剂设置不同的检测范围，存在重要或常见的病原体漏检的可能。因此，对于不同的感染症候群，有待于形成以临床最关注病原体为核心，并明确规范最低检测范围的行业共识或团体标准，以便提高tNGS检测的临床实用性。2 .低载量病原体的检测偏向性：对于超多重PCR法的tNGS,首先面临的挑战是如何提高扩增反应的能力/效率，以允许在每个PCR周期中有效扩增起始量差别较大的靶标；第二个挑战是在存在大量引物的情况下保持目标扩增特异性前30o对于探针捕获法的tNGS,同样面临杂交捕获时低载量病原体片段的捕获效率相对偏低的情况。此外，如果采用多样本混合进行杂交捕获，还存在高载量

36、病原样本数据占比较高，低载量病原样本数据量不足，导致灵敏度下降的可能。因此，对低载量病原体应溯源生信分析和结果报告过程，并结合免疫状态、宿主因素、验证指标、影像特征、传统微生物检测结果等临床信息进行综合分析，必要时联系临床开展病例讨论。3 .污染防控：对于超多重PCR法的tNGS,扩增时靶标的模板量可能会放大到上百万倍，同时在文库构建中有开盖的操作，因此扩增产物很容易形成气溶胶而对同批次样本和后续批次样本的检测造成干扰，导致假阳性结果。对于探针捕获法的tNGS,检测环节增加了杂交、洗脱等步骤，导致低序列结果检出时，来源于交叉污染的可能性相对mNGS有所提高。此外，人员操作的不规范也是污染引入的

37、来源之一。因此，针对不同技术路线的特点，实验室需建立确切可行的实验室污染预警和防控体系，建立基于自动化工作站的全自动或半自动实验流程，并做好人员培训和定期考核，有助于污染的防控和污染来源的追溯。八、前景与总结感染性疾病是临床面临的主要疾病之一,存在多重、疑难、危重、特殊感染等，而经验性使用抗微生物药物将可能加重耐药微生物产生和播散，因此快速准确鉴定病原体是实现临床精准治疗、有效监测、控制传播和降低医疗负担的重要环节。相对于mNGS,tNGS检测的成本较低，且受人源影响较小；相对于荧光定量PCR和多重PCR,tNGS检测能覆盖更多病原体。止匕外，tNGS可联合镜检、培养、免疫学等传统方法，在病原体诊断中发挥关键作用。但tNGS仍有一定的局限性，其体系构建、污染防控、质量控制、稳定性等仍需要进一步关注并标准化。目前tNGS技术还在不断发展，本共识的观点仍有不断完善的空间，随着临床应用的普及和经验的积累，临床数据和检测技术迭代发展，有望发挥tNGS早诊早治的优势，为实现感染性疾病精准诊疗提供技术保障。