分子流行病学PPT课件.ppt

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1、分子流行病学分子流行病学MolecularEpidemiologyContents1.Introduction2.Researchmethods3.Briefintroductiontocommonlaboratorytechniques4.Utilizationofmolecularepidemiology5.Exampleformolecularepidemiologicalresearches6.Prospect(lookintothefuture)SectiononeIntroduciton一、分子流行病学的概念及其发展一、分子流行病学的概念及其发展Definitionandprogr

2、essesofmolecularepidemiology（一）分子流行病学的概念（一）分子流行病学的概念Definitionofmolecularepidemiology分分子子流流行行病病学学(molecularepidemiology)是是应应用用分分子子生生物物学学的的基基本本理理论论和和技技术术，研研究究疾疾病病或或健健康康的的人人群群现现象象。它它从从分分子子水水平平揭揭示示影影响响疾疾病病或或健健康康分分布布的的因因素素，为为更更有有效效地地控控制制疾疾病病和和促促进进健健康康提提供供基基因因或分子水平的研究方法和防治手段。或分子水平的研究方法和防治手段。Molecular epi

3、demiology is a branch of epidemiology that combines theories and methods in both epidemiology and molecular biology.What defines molecular epidemiology,as opposed to conventional epidemiology,is its use of biological and in particular genetic markers as a measure of the propensity of developing a di

4、sease or as an indicator of a disease or an exposure in the study of the distribution and cause of disease.Molecular epidemiology has the same objectives as conventional epidemiology:to study the occurrence,development and prognosis of disease,to evaluate the effectiveness of preventive and therapeu

5、tic interventions,and to provide essential evidence for clinical and healthcare decision making.概念的演变：概念的演变：近近20年来分子生物学被引入流行病学研究领域。年来分子生物学被引入流行病学研究领域。使流行病学研究中的组间比较更为准确；使流行病学研究中的组间比较更为准确；对发病机制的认识更为明确；对发病机制的认识更为明确；对暴露与疾病发生过程的研究更为精确。对暴露与疾病发生过程的研究更为精确。目前，分子流行病学成为现代流行病学的一个重目前，分子流行病学成为现代流行病学的一个重要组成部分。要组成部

6、分。最早使用最早使用“分子流行病学分子流行病学”这一术语的是这一术语的是Kilboure，他于他于1972年用分子生物学技术探讨了流感病毒抗原变年用分子生物学技术探讨了流感病毒抗原变异与流感大流行之间的相互关系，旨在通过研究病毒异与流感大流行之间的相互关系，旨在通过研究病毒分子结构，来阐明流感发生大流行的原因。分子结构，来阐明流感发生大流行的原因。但作者并未解释但作者并未解释“分子流行病学分子流行病学”的涵义。之后有的涵义。之后有关学者相继使用这一术语，不断有一些解释。关学者相继使用这一术语，不断有一些解释。1993年年Schulte出版了第一部分子流行病学专著，出版了第一部分子流行病学专著，

7、并给分子流行病学定义为，并给分子流行病学定义为，“在流行病学研究中，应在流行病学研究中，应用生物学标志物，包括生化的、分子的、生理学的、用生物学标志物，包括生化的、分子的、生理学的、免疫学的、遗传学的等信号，这些事件信号代表致免疫学的、遗传学的等信号，这些事件信号代表致病因子与所致疾病之间连续过程中一个个相关的环病因子与所致疾病之间连续过程中一个个相关的环节。节。”（二）血清流行病学定义（二）血清流行病学定义 血血清清流流行行病病学学(seroepidemiologyseroepidemiology)是是应应用用血血清清学学方方法法检检测测人人群群中中特特异异性性抗抗原原、抗抗体体、各各种种代

8、代谢谢产产物物、遗遗传传标标记记、生生化化指指标标、营营养养成成分分等等血血液液成成分分，借借以以了了解解疾疾病病或或健健康康状状况况在在人人群群中中的的分分布布及及其其影影响响因因素素，探探讨讨疾疾病病发发生生的的原原因因并并评评价价预预防防措措施施的的效效果果。血血清清流流行行病学是流行病学的一个重要分支之一。病学是流行病学的一个重要分支之一。血清流行病学有狭义和广义之分。血清流行病学有狭义和广义之分。而广义上的血清流行病学实际上由于分而广义上的血清流行病学实际上由于分子流行病学的迅猛发展，已逐步融入分子流子流行病学的迅猛发展，已逐步融入分子流行病学之中，实际上已属于分子流行病学的行病学之

9、中，实际上已属于分子流行病学的研究范畴。所以，我们不再将血清流行病学研究范畴。所以，我们不再将血清流行病学单作一章介绍，而是并于分子流行病学这一单作一章介绍，而是并于分子流行病学这一章中一并介绍，更具实际意义，也更有助于章中一并介绍，更具实际意义，也更有助于读者对分子流行病学的理解。读者对分子流行病学的理解。二、与传统流行病学的关系二、与传统流行病学的关系Relationshipbetweenconventionalandmolecularepidemiology分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间的的“黑匣子黑匣子”之谜。之谜。Conventional C

10、onventional EpidemiologyEpidemiologyExposure DiseaseMolecular Molecular EpidemiologyEpidemiology 暴露标志暴露标志 疾病标志疾病标志暴露暴露 内剂量内剂量 生物学生物学 早期生物早期生物 结构和结构和 临床疾病临床疾病 预后意义预后意义 效应剂量效应剂量 学效应学效应 功能改变功能改变 易感性标志易感性标志 传统流行病学与分子流行病学的关系传统流行病学与分子流行病学的关系传统流行病学与分子流行病学的关系传统流行病学与分子流行病学的关系三、分子流行病学的发展三、分子流行病学的发展Progressofm

11、olecularepidemiology分子生物学技术的不断发展：分子生物学技术的不断发展：1分子流行病学的研究方法越来越多分子流行病学的研究方法越来越多：如在分子流行病学产生的初期，主要研究手段是质粒如在分子流行病学产生的初期，主要研究手段是质粒图谱分析、核酸杂交等技术，且程序烦琐、费事费力，目图谱分析、核酸杂交等技术，且程序烦琐、费事费力，目前许多新的技术已应用于分子流行病学研究，且可自动化前许多新的技术已应用于分子流行病学研究，且可自动化或半自动化测定，如聚合酶链反应（或半自动化测定，如聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）、）、DNA序列分析、酶定量分析

12、等等。序列分析、酶定量分析等等。2研究内容越来越多研究内容越来越多：已从研究传染病的病原体、：已从研究传染病的病原体、传染源、传播途径，逐渐延伸至非传染性疾病或健康状态，传染源、传播途径，逐渐延伸至非传染性疾病或健康状态，以及人群易感性和疾病预防、治疗措施的评价等等。以及人群易感性和疾病预防、治疗措施的评价等等。3应用范围越来越大应用范围越来越大：从预防医学到整个生命科学。：从预防医学到整个生命科学。SectiontwoResearchmethods一、生物标志的确定与标本采集一、生物标志的确定与标本采集Determinationofbiomarkersandcollectionofspeci

13、mens（一一）生生 物物 标标 志志 的的 确确 定定(determinationofbiomarkers)生生物物标标志志(biomarker)分分为为三三大大类类，即即暴暴露露标标志志(exposuremarker)、效效应应标标志志(effectmarker)和和易易感感标标志志(susceptibilitymarker)。这三类标志只不过是些笼统指标，具体到某一种这三类标志只不过是些笼统指标，具体到某一种疾病或健康状况，应根据研究内容与目的确定与之密疾病或健康状况，应根据研究内容与目的确定与之密切相关连的具体标志。切相关连的具体标志。1.暴露标志的选择暴露标志的选择(selectio

14、n of exposure markers)应应选选择择那那些些最最具具代代表表暴暴露露剂剂量量而而又又十十分分客客观观、稳稳定定、敏感、特异的标志。敏感、特异的标志。暴暴露露标标志志是是指指那那些些与与疾疾病病或或健健康康有有关关的的暴暴露露因因素素的的生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。外外暴暴露露标标志志(externalexposuremarker)：暴暴露露因因素素进进入入机机体体之之前前的的标标志志，如如病病毒毒、细细菌菌、支支原原体体等等微微生生物物及毒素、粉尘、烟雾、化学致癌物等。及毒素、粉尘、烟雾、化学致癌物等。内内暴暴露露标标志志(i

15、nternalexposuremarker)：暴暴露露因因素进入机体之后的标志。素进入机体之后的标志。2.效应标志的选择效应标志的选择(selection of effect markers)机体在暴露于有关危险因子以后到疾病发生这期机体在暴露于有关危险因子以后到疾病发生这期间，会产生与之相对应的生物学效应间，会产生与之相对应的生物学效应(biologicaleffect)或称为生物学反应或称为生物学反应(biologicalresponse)。因因此，可以产生功能性或结构性变化的生物标志，如发此，可以产生功能性或结构性变化的生物标志，如发生变异的基因、产生的特异性产物等。生变异的基因、产生的

16、特异性产物等。应选择那些最能代表生物学效应实际情况的标志，应选择那些最能代表生物学效应实际情况的标志，且同样应具特异、敏感、简便等优点。且同样应具特异、敏感、简便等优点。3.易感标志的选择易感标志的选择(Selection of susceptibility marker)易感标志是指机体对疾病发生、发展易感程度易感标志是指机体对疾病发生、发展易感程度的生物标志。的生物标志。在确定易感人群时，通常选择免疫学指标和在确定易感人群时，通常选择免疫学指标和易感基因作为易感测定标志。易感基因作为易感测定标志。（二）标本的采集（二）标本的采集(Collectionofspecimens)标本的采集、运送

17、和储存是实验室分析标本的采集、运送和储存是实验室分析的第一步，也是很关键的一步。为了采集高的第一步，也是很关键的一步。为了采集高质量的标本，应注意以下几个问题：质量的标本，应注意以下几个问题：1.采集最适标本采集最适标本(Collectionofoptimalspecimens)首要问题是有的放矢，一般根据已有流行病首要问题是有的放矢，一般根据已有流行病学资料和疾病的临床表现进行分析，初步推断可学资料和疾病的临床表现进行分析，初步推断可能是哪类疾病，再根据发病规律和病程决定采集能是哪类疾病，再根据发病规律和病程决定采集何种标本。何种标本。可以从以下几个方面考虑取材部位：可以从以下几个方面考虑取

18、材部位：从病原体入侵部位取材；从病原体入侵部位取材；从病原体感染的靶器官取材；从病原体感染的靶器官取材；根据病原体的排泄途径取材；根据病原体的排泄途径取材；非传染性疾病主要从受损组织取材或其它非传染性疾病主要从受损组织取材或其它能反映效应指标的标本；能反映效应指标的标本；直接采集病原标本。直接采集病原标本。此外，根据疾病的种类、病情采集标本。有此外，根据疾病的种类、病情采集标本。有的疾病需要在发病的早期采集标本，有的则需要的疾病需要在发病的早期采集标本，有的则需要在早期和晚期采集标本。在早期和晚期采集标本。常采集的标本有：常采集的标本有：病原体标本；病原体标本；体液标本，体液标本，如血液、尿液

19、胃液、精液、如血液、尿液、胃液、精液、分泌物等；分泌物等；组织标本，组织标本，如机体各种组织、毛发、如机体各种组织、毛发、媒介体等。媒介体等。2.标本的运送与储存标本的运送与储存(Transport and storage of specimens)标本采集后应尽快送往实验室，马上检测最好标本采集后应尽快送往实验室，马上检测最好，如不能马上进行应注意适当保存。根据情况可采取如不能马上进行应注意适当保存。根据情况可采取冷冻、冷藏运输，以保持活性。冷冻、冷藏运输，以保持活性。采集的标本应放入适当的容器，采集的标本应放入适当的容器，以不易损坏和以不易损坏和泄漏，特别是烈性病原体标本，应加金属套罐，

20、派泄漏，特别是烈性病原体标本，应加金属套罐，派专人专车运送。专人专车运送。采集的标本除了防止扩散，采集的标本除了防止扩散，也应防止被污染包也应防止被污染包括生物性的、化学的或其它标本的污染。括生物性的、化学的或其它标本的污染。采集的标本储存后应不影响检测结果，采集的标本储存后应不影响检测结果，即在任即在任何时间检测都可获得一致的结果。何时间检测都可获得一致的结果。所有的标本都应有详细的记录和标签所有的标本都应有详细的记录和标签等。等。二、常用实验室方法二、常用实验室方法(Commonlabmethods)（一）核酸研究方法一）核酸研究方法(Researchmethodsofnucleicaci

21、d)随着分子生物学和分子遗传学的发展，人们随着分子生物学和分子遗传学的发展，人们清楚地了解到生物的任何性状（表型）是由于其清楚地了解到生物的任何性状（表型）是由于其本身的遗传物质本身的遗传物质核酸（核酸（DNA或或RNA）所决所决定的。对于核酸的分析最能客观地反映各种生物定的。对于核酸的分析最能客观地反映各种生物现象（效应）的本质。现象（效应）的本质。1.核核酸酸中中碱碱基基含含量量的的测测定定(Assay of basyl content in nucleic acid)常用的是常用的是G+C含量的测定。亲缘关系近的含量的测定。亲缘关系近的病原体，它们的病原体，它们的G+C含量相同或近似，亲

22、缘关含量相同或近似，亲缘关系远的病原体，它们的含量不同。系远的病原体，它们的含量不同。因此，可用于传染病传染源和传播途径的因此，可用于传染病传染源和传播途径的分析。但在某些情况下，分析。但在某些情况下，G+C含量相同或近似含量相同或近似的病原体其亲缘关系不一定近似。因为上述分的病原体其亲缘关系不一定近似。因为上述分析只反映了核酸的核苷酸组成，并不能反映核析只反映了核酸的核苷酸组成，并不能反映核苷酸序列。苷酸序列。2.核酸电泳和限制性内切酶图谱分析核酸电泳和限制性内切酶图谱分析(Nucleic acid electrophoresis and restriction enzyme analysi

23、s)某些病原体，如引起腹泻的轮状病毒，它们的核某些病原体，如引起腹泻的轮状病毒，它们的核酸是分节段的，直接提取核酸即可进行琼脂糖凝胶电酸是分节段的，直接提取核酸即可进行琼脂糖凝胶电泳，产生特定的电泳带，每一型的轮状病毒的电泳带泳，产生特定的电泳带，每一型的轮状病毒的电泳带具有特定的数目和大小、分布特征等。具有特定的数目和大小、分布特征等。其它大多数病原体或生物标本的核酸，可用限制其它大多数病原体或生物标本的核酸，可用限制性内切酶酶切消化以后，再进行电泳分析，不同的病性内切酶酶切消化以后，再进行电泳分析，不同的病原体或生物标本产生不同电泳图谱。原体或生物标本产生不同电泳图谱。图2 T-A克隆后酶

24、切鉴定结果 Fig 2 Enzyme digestion analysis of T-AFig 2 Enzyme digestion analysis of T-A control clone fragment of JR23 control clone fragment of JR23 strain strain 3.核酸杂交核酸杂交(nucleic acid hybridyzation)核酸杂交需要一个探针核酸杂交需要一个探针(probe)，即一种标有示踪即一种标有示踪分子的特异单链分子的特异单链DNA或或RNA分子，这种探针分子，这种探针可与待测标本中的特异性序列结合。可与待测标本中的特

25、异性序列结合。常用于生物标本中病原体特异核苷酸序列常用于生物标本中病原体特异核苷酸序列的检测。的检测。常用的有斑点杂交、原位杂交、转印杂交常用的有斑点杂交、原位杂交、转印杂交等方法。等方法。4.寡核苷酸指纹图寡核苷酸指纹图(oligonucleotide finger printing)病原体或生物标本的核酸经特定的酶消化病原体或生物标本的核酸经特定的酶消化后，可进行双向电泳，然后再进行放射自显影，后，可进行双向电泳，然后再进行放射自显影，显示出一定的图谱特征，称为指纹图显示出一定的图谱特征，称为指纹图(fingerprinting)。此图谱具有特异性。此图谱具有特异性。常用于微生物同源性分析

26、常用于微生物同源性分析。5.质粒图谱分析质粒图谱分析(plasmid figure analysis)不同的细菌的质粒不同的细菌的质粒DNA不同，因此可对不同，因此可对质粒质粒DNA进行酶切反应、电泳、图谱分析。进行酶切反应、电泳、图谱分析。常用于微生物同源性分析。常用于微生物同源性分析。6.PCR(polymerase chain reaction)PCR是一种是一种80年代初发展起来的一种高效年代初发展起来的一种高效体外基因体外基因DNA扩增技术，需要一对寡核苷酸引扩增技术，需要一对寡核苷酸引物（上游和下游各一），在耐热的物（上游和下游各一），在耐热的DNA多聚酶多聚酶的作用下，合成特异

27、的的作用下，合成特异的DNA序列，包括高温变序列，包括高温变性、低温退火、中温引物延伸三个步骤，这三性、低温退火、中温引物延伸三个步骤，这三个步骤反复循环，在短时间内可扩增至几百万个步骤反复循环，在短时间内可扩增至几百万倍。倍。此法具有高度特异、敏感、快速、简便等此法具有高度特异、敏感、快速、简便等优点。优点。常用于基因扩增、克隆、标本中特异性核常用于基因扩增、克隆、标本中特异性核苷酸序列检测等。苷酸序列检测等。7.DNA序列分析序列分析(DNAsequencing)DNA序列分析有了很大的发展，常用双脱序列分析有了很大的发展，常用双脱氧末端终止法。由于与计算机相结合产生了自氧末端终止法。由于

28、与计算机相结合产生了自动化分析仪，使核酸序列分析变得非常简便、动化分析仪，使核酸序列分析变得非常简便、快速、准确、可靠。快速、准确、可靠。该方法是所有核酸分析技术中最可靠的一该方法是所有核酸分析技术中最可靠的一种方法，可用于任何来源的两个或多个种方法，可用于任何来源的两个或多个DNA片片段之间核苷酸序列的比较。段之间核苷酸序列的比较。所以，是追踪传染源、分析传播途径、阐所以，是追踪传染源、分析传播途径、阐明流行规律十分可靠的分子流行病学方法。明流行规律十分可靠的分子流行病学方法。8.单链构象多态性分析单链构象多态性分析(single-strandedconformationpolymorphi

29、sm,SSCP)是将基因扩增产物变性为单链核酸，然后是将基因扩增产物变性为单链核酸，然后进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），），观察区带的迁移率。由于迁移率与核酸的构象观察区带的迁移率。由于迁移率与核酸的构象密切相关，只有一个核苷酸的突变就可以改变密切相关，只有一个核苷酸的突变就可以改变分子构象，因而表现在电泳迁移率上的差别。分子构象，因而表现在电泳迁移率上的差别。此法可以检测基因突变。但不能确定基因此法可以检测基因突变。但不能确定基因变异的位点及方式，最后还需要进行序列测定。变异的位点及方式，最后还需要进行序列测定。SSCP可用于病原体和生物标本的研究

30、可用于病原体和生物标本的研究。9.基基因因定定点点突突变变技技术术(Site-directedmutagenesis)此此技技术术可可随随意意在在克克隆隆的的基基因因上上进进行行突突变变，然然后后测测量量突突变变后后基基因因功功能能的的改改变变。常常用用于于基基因结构与功能的研究。因结构与功能的研究。（二）蛋白质研究方法（二）蛋白质研究方法(Researchmethodsofproteins)只要有蛋白质在，就有基因在，蛋白质是只要有蛋白质在，就有基因在，蛋白质是基因表达的产物，几乎所有生物体都具有蛋白基因表达的产物，几乎所有生物体都具有蛋白质，包括结构蛋白和功能蛋白。对蛋白质进行质，包括结

31、构蛋白和功能蛋白。对蛋白质进行研究分析，实际上是间接地对其相对应的基因研究分析，实际上是间接地对其相对应的基因进行分析，因为蛋白质的氨基酸（进行分析，因为蛋白质的氨基酸（aa）顺序是顺序是由相对应的核苷酸顺序决定的，因此蛋白质分由相对应的核苷酸顺序决定的，因此蛋白质分析也具有特异性。析也具有特异性。蛋白质技术包括蛋白质技术包括PAGE、肽图分析肽图分析(peptidemapping)、转印技术、色谱技术、测序技术等。转印技术、色谱技术、测序技术等。（三）酶学技术（三）酶学技术(Enzymatictechniques)大多数酶属于蛋白质，因此可以用分离大多数酶属于蛋白质，因此可以用分离蛋白质的方

32、法分离酶，并可在特定条件下定蛋白质的方法分离酶，并可在特定条件下定性、定量测定其活性，同样也可以测其分子性、定量测定其活性，同样也可以测其分子量。量。（四）免疫学技术（四）免疫学技术(Immunologicaltechniques)分子流行病学的研究中，常用分子免疫学分子流行病学的研究中，常用分子免疫学标记技术，如酶标记（标记技术，如酶标记（EIA）、）、荧光标记（荧光标记（FIA）、）、放射标记（放射标记（RIA）三大标记技术。三大标记技术。单克隆抗体（单克隆抗体（McAb）技术的应用为免疫学技术的应用为免疫学技术开辟了新的天地，不仅可以用于疾病的诊、技术开辟了新的天地，不仅可以用于疾病的诊

33、治，还可用于病原体同源性分析等。治，还可用于病原体同源性分析等。（五）生物芯片技术（五）生物芯片技术(Biochiptechniques)生生物物芯芯片片(biochip)技技术术是是近近几几年年才才发发展展起起来来的的一一种种基基于于分分子子杂杂交交原原理理的的检检测测技技术术。它它是是通通过过缩缩微微技技术术，根根据据分分子子间间特特异异性性地地相相互互作作用用原原理理，将将生生命命科科学学领领域域中中不不连连续续的的分分析析过过程程集集成成于于硅硅芯芯片片或或玻玻璃璃芯芯片片表表面面的的微微型型分分析析系系统统，以以便便对对细细胞胞、蛋蛋白白质质、基基因因或或其其它它生生物物组组分分的

34、的准准确确、快快速速、大大信信息息量量的的检检测。测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。与传统的仪器检测相比，生物芯片有高组织芯片。与传统的仪器检测相比，生物芯片有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等优点。通量、微型化、自动化、成本低、防污染等优点。目前最成功的是基因芯片。目前最成功的是基因芯片。（六）其他技术（六）其他技术(othertechniques)分分子子流流行行病病学学应应用用的的实实验验室室技技术术很很多多，除除了了上上述述介介绍绍的

35、的技技术术外外，还还有有各各种种色色谱谱技技术术、毛毛细细管管电电泳泳技技术术、其其他他理理化化分分析析等等实实验验室室技技术。术。当然分子流行病学研究方法也离不开传当然分子流行病学研究方法也离不开传统流行病学的现场流行病学研究方法，即描统流行病学的现场流行病学研究方法，即描述性、分析性、干预性研究等（见有关章节）述性、分析性、干预性研究等（见有关章节）。传统流行病学研究方法结合生物学标志检。传统流行病学研究方法结合生物学标志检测，从分子或基因水平更深一层次揭示病因、测，从分子或基因水平更深一层次揭示病因、致病机制等，是当前常用的分子流行病学研致病机制等，是当前常用的分子流行病学研究模式。究模

36、式。三、研究设计要点三、研究设计要点(Keypointsforresearchdesign)分子流行病学研究设计，是在传统流行病学研究设计分子流行病学研究设计，是在传统流行病学研究设计的原理和模式的基础上，再考虑分子生物学技术或生物学的原理和模式的基础上，再考虑分子生物学技术或生物学标志的应用带来的有关问题。标志的应用带来的有关问题。生物学标志是指代表生物生理、组织、细胞、亚细胞生物学标志是指代表生物生理、组织、细胞、亚细胞以及大分子的可识别物质。如前所述，分子流行病学就是以及大分子的可识别物质。如前所述，分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间的要揭开暴露与疾病之间的“黑匣子黑匣子”之谜。之谜。

37、因此，因此，在进行分子流行病学研究设计时，首先应按照在进行分子流行病学研究设计时，首先应按照传统流行病学研究设计的一般要求，如明确的研究目的，传统流行病学研究设计的一般要求，如明确的研究目的，选择有代表性的样本及数量，各种对照组的设置，对照组选择有代表性的样本及数量，各种对照组的设置，对照组和实验组的可比性、方法的准确性、合适的资料统计分析和实验组的可比性、方法的准确性、合适的资料统计分析方法、偏倚的控制等。方法、偏倚的控制等。这些是流行病学研究的最基本要点，如果脱离这些要这些是流行病学研究的最基本要点，如果脱离这些要点，即使在研究中使用了先进的实验室技术，也得不到准点，即使在研究中使用了先进

38、的实验室技术，也得不到准确的研究结果。确的研究结果。以下几点供进行分子流行病学研究设计时参考。以下几点供进行分子流行病学研究设计时参考。（一）明确研究目的（一）明确研究目的进行研究设计时首先要明确该研究要解决的问题，进行研究设计时首先要明确该研究要解决的问题，确实做到有的放矢。确实做到有的放矢。（二）选择客观准确的测定指标（二）选择客观准确的测定指标研究中所选择的各种研究中所选择的各种“标志标志”，必须是，必须是客观客观的、的、稳稳定定的和的和有代表性有代表性的测定指标，并且的测定指标，并且容易检测容易检测到。到。生物学标志的选择是否恰当，决定着分子流行病生物学标志的选择是否恰当，决定着分子流

39、行病学研究的成败。学研究的成败。（三）选择科学的测定方法（三）选择科学的测定方法所选择的测定方法应结合实验室条件，使用所选择的测定方法应结合实验室条件，使用简便简便快速、成熟可靠、被公认的测定方法快速、成熟可靠、被公认的测定方法。应用新的测定。应用新的测定方法时，应注意所得结果和其他方法所得结果的可比方法时，应注意所得结果和其他方法所得结果的可比性。性。（四）研究模式的选择（四）研究模式的选择流行病学研究设计模式一般分为描述流行病学、流行病学研究设计模式一般分为描述流行病学、分析流行病学和实验流行病学研究模式。不论那种研分析流行病学和实验流行病学研究模式。不论那种研究模式，都可以引入分子生物学

40、理论和技术，构成分究模式，都可以引入分子生物学理论和技术，构成分子流行病学研究。子流行病学研究。实验中应根据实际情况选择适当的研究模式。实验中应根据实际情况选择适当的研究模式。（五）样本的选择（五）样本的选择样本的选择是任何流行病学研究中不可避免的问题，样本的选择是任何流行病学研究中不可避免的问题，分子流行病学研究样本的选择其原理和方法与一般流行分子流行病学研究样本的选择其原理和方法与一般流行病学研究设计相同，但对分子流行病学来说，样本及其病学研究设计相同，但对分子流行病学来说，样本及其大小的选择难度更大一点。大小的选择难度更大一点。要特别注意样本来源的地区、要特别注意样本来源的地区、人群、遗

41、传因素和环境因素的交互作用。人群、遗传因素和环境因素的交互作用。（六）质量控制（六）质量控制质量控制是分子流行病学研究设计中一个重要部分，质量控制是分子流行病学研究设计中一个重要部分，它直接关系到所得结果的准确性、可靠性、科学性和可它直接关系到所得结果的准确性、可靠性、科学性和可信性。信性。1.一般性实验质量控制一般性实验质量控制 确定标本采集方案：确定标本采集方案：包括采集部位、时间及方法；包括采集部位、时间及方法；标本采集后的贮存问题等；标本采集后的贮存问题等；药品和试剂的选择：药品和试剂的选择：同一测定指标最好使用同一同一测定指标最好使用同一批号的药品和试剂。更换批号时应进行对比和标准化

42、批号的药品和试剂。更换批号时应进行对比和标准化；实验方法的确定：实验方法的确定：对于同一种生物标志的测定要对于同一种生物标志的测定要用统一的方法；用统一的方法；仪器设备的确定：仪器设备的确定：如无特殊情况，不要更换仪器。如无特殊情况，不要更换仪器。调校后一般不应重新调校；调校后一般不应重新调校；操作要规范化：操作要规范化：每一实验步骤都要规范化，保证每一实验步骤都要规范化，保证同一操作者或操作者之间的可重复性。同一操作者或操作者之间的可重复性。2.设立多种对照设立多种对照实验开始前就应设立好对照，一般应设以下对照：实验开始前就应设立好对照，一般应设以下对照：标准对照（阳性对照）：标准对照（阳

43、性对照）：是指含有待测或某种生物是指含有待测或某种生物标志，并已知其含量的生物标本；标志，并已知其含量的生物标本；空白对照（阴性对照）空白对照（阴性对照）：是指不含待测或某种生物：是指不含待测或某种生物标志的生物标本；标志的生物标本；重复对照（相关对照）：重复对照（相关对照）：是指来源于同一份待测生是指来源于同一份待测生物标本具有不同编号的多份生物标本或与待测生物标本有物标本具有不同编号的多份生物标本或与待测生物标本有关系的生物标本。关系的生物标本。3.预实验预实验正式实验开始前应进行预实验，确保所用方法的正式实验开始前应进行预实验，确保所用方法的可重复性。一般包括本实验室内和实验室之间不同操

44、可重复性。一般包括本实验室内和实验室之间不同操作者之间的交叉重复实验等。作者之间的交叉重复实验等。4.误差、偏倚的控制误差、偏倚的控制分子生物学技术虽然敏感、精确，但导致误差、分子生物学技术虽然敏感、精确，但导致误差、偏倚的因素也很多。包括偏倚的因素也很多。包括:检测者本身、试剂、药品、材料、仪器等；检测者本身、试剂、药品、材料、仪器等；同一受检者的生理生化变化；同一受检者的生理生化变化；人群中的生物遗传学差异等方面。人群中的生物遗传学差异等方面。应针对具体环节制定详细的质控方法。应针对具体环节制定详细的质控方法。（七）分析与总结（七）分析与总结(Analysesandsummary)在研究设

45、计中要预测研究结果，事先确定在研究设计中要预测研究结果，事先确定明确的资料统计分析方法，并拟定资料的总结、明确的资料统计分析方法，并拟定资料的总结、分析与报告的详细计划。分析与报告的详细计划。SectionthreeCommonlabtechniques正确应用实验技术是分子流行病学研究成功的关键。正确应用实验技术是分子流行病学研究成功的关键。（一）生物标本中核酸的提取（一）生物标本中核酸的提取(Extractionofnucleicacidfrombiospecimens)核酸携带有生物体的遗传物质，是生物体细胞的重要核酸携带有生物体的遗传物质，是生物体细胞的重要组成成分。组成成分。基因分型

46、变异分析、多态性分析、基因序列分析等基因分型、变异分析、多态性分析、基因序列分析等是分子流行病学研究中非常重要的手段之一。但在进行这是分子流行病学研究中非常重要的手段之一。但在进行这些分析之前，首先要提取和纯化核酸。些分析之前，首先要提取和纯化核酸。1.DNA的提取的提取(Extraction of DNA)通过破坏细胞质和细胞核膜后，再除去蛋白质通过破坏细胞质和细胞核膜后，再除去蛋白质可获得基因组可获得基因组DNA。基本过程：基本过程：（1）在）在EDTA和变性剂存在下加入蛋白酶和变性剂存在下加入蛋白酶K消消化除去蛋白质；化除去蛋白质；（2）用）用RNA酶除去酶除去RNA；（3）用酚和氯仿

47、抽提用酚和氯仿抽提DNA；（4）用乙醇和异丙醇把用乙醇和异丙醇把DNA从溶液中离心沉从溶液中离心沉淀出来。淀出来。2.RNA的提取的提取(Extraction of RNA)RNA提取的基本过程：提取的基本过程：裂解细胞；裂解细胞；除去蛋白质；除去蛋白质；提取核酸混合物；提取核酸混合物；将将RNA与与DNA分离。分离。（二二）质质粒粒DNA的的提提取取(Extraction of plasmidDNA)一般首先培养足够量的细菌，先将所研究的一般首先培养足够量的细菌，先将所研究的质粒质粒DNA转化感受态细菌，然后进行克隆，培转化感受态细菌，然后进行克隆，培养扩增一定量后，提取质粒养扩增一定量后，

48、提取质粒DNA进行其它分析。进行其它分析。提取方法很多，其共同点是：提取方法很多，其共同点是：离心沉淀细菌；离心沉淀细菌；裂解细菌；裂解细菌；除去细菌残壁、染色体除去细菌残壁、染色体DNA、RNA；异丙醇沉淀质粒异丙醇沉淀质粒DNA。实际应用中，有小量提取法和大量提取法之实际应用中，有小量提取法和大量提取法之分。分。（三）（三）DNA限制性内切酶酶切技术限制性内切酶酶切技术(Restriction endonuclease technique ofDNA)限制性内切酶限制性内切酶(restrictionendonuclease)是一类是一类能识别双链能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的分子中

49、特异核苷酸序列的DNA水水解酶，是基因工程、基因诊断、解酶，是基因工程、基因诊断、DNA序列分析中常序列分析中常用的工具酶。用的工具酶。因此，内切酶酶切技术是基因分子生物学中最因此，内切酶酶切技术是基因分子生物学中最基本、最重要的技术。基本、最重要的技术。限制性内切酶主要来自于原核细胞，每种酶都限制性内切酶主要来自于原核细胞，每种酶都有自己特定的反应条件如缓冲液、反应温度、作用有自己特定的反应条件如缓冲液、反应温度、作用时间等，根据研究目的可选用小量酶解反应，大量时间等，根据研究目的可选用小量酶解反应，大量酶解反应和双酶解反应等。然后进行琼脂糖凝胶电酶解反应和双酶解反应等。然后进行琼脂糖凝胶电

50、泳，对酶切产物（泳，对酶切产物（DNA片段）进行鉴定分析。片段）进行鉴定分析。表表1限制性内切酶酶切反应的一般条件限制性内切酶酶切反应的一般条件条件条件反应类型反应类型小量小量(分析用分析用)大量大量(制备用制备用)反应体积反应体积20l根据需要根据需要DNA量量0.5-1.0g根据需要根据需要酶用量酶用量1-2u/gDNA1-2u/gDNA10 x缓冲液缓冲液2l根据需要根据需要牛血清白蛋白牛血清白蛋白100g/ml100g/ml反应温度反应温度根据需要根据需要根据需要根据需要反应时间反应时间2h2h(可适当延长可适当延长)（四）（四）DNA重组技术重组技术(Recombinationtec