荧光定量PCR的原理及应用.ppt
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1、 大型仪器管理中心黄雪玲2010-9-27实时荧光定量实时荧光定量PCR原理及其应用原理及其应用荧光定量PCR仪的应用v基础研究中基因表达丰度的测定;v差异基因的表达检测,基因型分析;v临床医疗领域病原体的检测和基因诊断:包括特定基因的检测、细菌和病毒等病原体的检测;v环境监测,包括水质、空气的污染检验;v检验检疫工作:食品卫生检验,转基因作物的检验;v法医的遗传学鉴定;PCR的反应过程的反应过程CycleFluorescence实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR(Real-time Q-PCR)技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积,实时监测整个PCR进程,最后通过参
2、照标准曲线对反应体系中未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR中的三个概念增长曲线增长曲线 (primary curve)荧光阈值(荧光阈值(threshold)CT 值值(Cycle Threshold)增长曲线增长曲线 反映荧光强度与循环数的对应关系反映荧光强度与循环数的对应关系CycleFluorescence域值域值:PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。荧光域值(荧光域值(Threshold)的设定的设定Ct值值Ct值:C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系值与起始模板的
3、关系 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多,CT值越小;模板DNA的起始拷贝数越少,CT值越大。一般正常的CT值范围在15-35之间,过大和过小都将影响实验数据的精度。荧光定量荧光定量PCR标记方法标记方法 内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探针序列特异性探针TaqmanTaqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 AmplifluorAmplifluor(IntergenInterg
4、en)5353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I SYBR Green I优点:u使用方便,可以应用于不同的模板u灵敏,便宜缺点:u与非特异性产物结合,但可以通过熔解曲线进行辨别熔解温度(Tm值)Tm值:50%DNA变成单链时的温度,此温度与双链DNA的长度、GC含量有关,可部分代表序列的特异性。Melt Curve AnalysisRQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记
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- 荧光 定量 PCR 原理 应用
