生物工程中国药科大学.ppt

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1、生生 物物 工工 程程谭谭树树华华博士、教授博士、教授中国药科大学生物制药学院中国药科大学生物制药学院参考书目录参考书目录BOOKSMolecularBiologyAndBiotechnology(Edited by J.M.Walker and E.B.Gingold)MolecularBiotechnologyPrinciplesandApplicationsofRecombinantDNA(Edited by Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak)Pharmaceutical Biotechnology(Edited by Daan J A Cromm

2、elin and Robert D Sindelar)现代生物工程现代生物工程焦炳华、孙树汉主编焦炳华、孙树汉主编现代生物技术导论现代生物技术导论瞿礼嘉、顾红雅、胡苹瞿礼嘉、顾红雅、胡苹 编著编著生物技术药物生物技术药物马大龙主编马大龙主编基因工程原理与方法基因工程原理与方法 孙树汉主编孙树汉主编JOURNALSNATURE BIOTECHNOLOGYTRENDS IN BIOTECHNOLOGY MOLECULAR BIOTECHNOLOGY 药物药物 化学药物化学药物 中药中药 生物药物生物药物 天然生化药物天然生化药物生物工程生物工程（技术）药物（技术）药物药物分类药物分类第一章第一章

3、绪论绪论第一节第一节 生物工程的概念生物工程的概念生物工程（技术）：生物工程（技术）：就是利用生物有就是利用生物有机体（这些生物有机体包括从微生物机体（这些生物有机体包括从微生物至高等动、植物）或其组成部分（包至高等动、植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种技术体系。展新产品或新工艺的一种技术体系。现代生物工程被列为当今世界公认的七现代生物工程被列为当今世界公认的七大高新技术之首（现代生物工程技术、航天工大高新技术之首（现代生物工程技术、航天工程技术、信息工程技术、激光工程技术、自动程技术、信息工程技术、激光工程技术、自动化

4、工程技术、新能源工程技术和新材料工程技化工程技术、新能源工程技术和新材料工程技术。生物工程之所以受到世界各国的如此重视，术。生物工程之所以受到世界各国的如此重视，是因为它在解决人类所面临的诸如食物短缺、是因为它在解决人类所面临的诸如食物短缺、人类健康、环境污染和资源匮乏等重大问题上人类健康、环境污染和资源匮乏等重大问题上有着无可比拟的优势和巨大潜力。它已广泛应有着无可比拟的优势和巨大潜力。它已广泛应用于医药卫生、农林牧渔、轻工、食品、化工用于医药卫生、农林牧渔、轻工、食品、化工和能源等领域，并以对人类社会生活产生了深和能源等领域，并以对人类社会生活产生了深远的革命性影响远的革命性影响。第二节第

5、二节 生物工程主要研究内容生物工程主要研究内容1、基因工程、基因工程2、动物细胞工程、动物细胞工程3、酶工程、酶工程4、微生物工程、微生物工程生物技术发展史上的里程碑生物技术发展史上的里程碑 第三节第三节 生物技术制药的诞生与发展生物技术制药的诞生与发展生物技术药物生物技术药物（biopharmaceutics,Biotechbiopharmaceutics,Biotech drug):drug):利用生物体、生物组织、细胞或其成分，利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与生物学、微生物学与

6、免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法加工制造而成工程学和药学的原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。健的制品。其发展要追溯到其发展要追溯到1980年十月十五号，年十月十五号，纽约股票交易所开盘后纽约股票交易所开盘后20分钟内，生物制分钟内，生物制药公司药公司Genentech的股票价格从的股票价格从$35到到$89,成为当时历史上上涨最快的股票。当时成为当时历史上上涨最快的股票。当时Genentech的年龄才的年龄才4岁，其原因是在这之岁，其原因是在这之前两年前两年1978年年Genentech成功地分离了人成功地分离了人

7、胰岛素的两条链的基因，并转入了大肠杆胰岛素的两条链的基因，并转入了大肠杆菌宿主细胞，这样就有可能利用大肠杆菌菌宿主细胞，这样就有可能利用大肠杆菌生产人的胰岛素，从而解决某些糖尿病患生产人的胰岛素，从而解决某些糖尿病患者对猪胰岛素过敏的问题。者对猪胰岛素过敏的问题。1982年世界上第一个基因工程年世界上第一个基因工程药物药物诞生了，由美国药物药物诞生了，由美国Lilly公司公司率先研制的重组人胰岛素经美国率先研制的重组人胰岛素经美国FDA批准投放市场，这标志着生物批准投放市场，这标志着生物制药技术进入了一个新纪元，也给制药技术进入了一个新纪元，也给广大的制药企业带来了无限的商机。广大的制药企业带

8、来了无限的商机。同时也向世人展示，以基因工程技同时也向世人展示，以基因工程技术为核心的现代生物技术药物具有术为核心的现代生物技术药物具有无限的发展应用前景和生命力无限的发展应用前景和生命力。据统计，全球生物工程制药产业的据统计，全球生物工程制药产业的年销售额年销售额1998年为年为149亿美元，到亿美元，到2007年已增长到年已增长到840亿美元，年增长速度连亿美元，年增长速度连续续10年保持在年保持在15%-33%，其中，销售，其中，销售额超过额超过10亿美元的亿美元的“重磅炸弹重磅炸弹”就有就有29种。由此可见，虽然生物技术制药种。由此可见，虽然生物技术制药的发展只有短短的发展只有短短20

9、几年，但已成为发几年，但已成为发展最快的高新技术产业之一。展最快的高新技术产业之一。我国的生物医药产业也发展势头我国的生物医药产业也发展势头良好，截止至良好，截止至2006年年4月，我国食品月，我国食品药品监督管理局药品监督管理局(SFDA)已批准了已批准了35种重组蛋白药物、治疗性抗体或基种重组蛋白药物、治疗性抗体或基因治疗产品上市，至因治疗产品上市，至2006年底，约年底，约有有50余种生物技术药物处于临床或余种生物技术药物处于临床或临床试验中。临床试验中。生物技术药物在临床上的应用生物技术药物生物技术药物(biotechdrugs，biopharmaceuticals）己广泛用于）己广泛

10、用于治疗癌症、艾滋病、冠心病、多发治疗癌症、艾滋病、冠心病、多发性硬化症、贫血、发育不良、糖尿性硬化症、贫血、发育不良、糖尿病、心力衰竭、血友病、囊性纤维病、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传疾病。变性和一些罕见的遗传疾病。生物技术药物的类别主要有三大类：主要有三大类：1、重组治疗蛋白质（酶、细、重组治疗蛋白质（酶、细胞因子、激素）胞因子、激素）2、重组疫苗、重组疫苗3、诊断或治疗用的单克隆抗、诊断或治疗用的单克隆抗体或基因工程抗体。体或基因工程抗体。20082008年美国处于临床试验的生物技术药物的分年美国处于临床试验的生物技术药物的分布图（按产品类型分）布图（按产品类型分）中国

11、医药生物技术 2009，4（2）：892007 2007 年销售额最高的年销售额最高的6 6大类生物技术药物大类生物技术药物 中国医药生物技术 2009，4（2）：892008年美国处于临床试验的生物技术药物的分布图（按适应症分）中国医药生物技术 2009，4（2）：89第四节第四节 美国及欧洲主要的生物技术药物美国及欧洲主要的生物技术药物公司公司Genetics InstituteGenetics InstituteBayerBayerCenteonCenteonGenentechGenentechGentocorGentocorBoehringerBoehringer MannheimMa

12、nnheimGalenusGalenus Mannheim MannheimEli LillyEli LillyOrtho BiotechOrtho BiotechHoechst AGHoechst AGAventisAventis PharmaceuticalsPharmaceuticalsGenzymeGenzymeSchwartz Schwartz PharmaPharmaPharmacia and UpjohnPharmacia and UpjohnBiotechnology GeneralBiotechnology GeneralSeronoSeronoOrganonOrganonA

13、mgenAmgenDompeDompe BiotecBiotecSchering PloughSchering PloughHoffman-la-RocheHoffman-la-RocheChironChironBiogenBiogenPasteur Pasteur MerieuxMerieux MSD MSDImmunomedicsImmunomedicsNovartisNovartisAbbottAbbottWyethWyethUnigeneUnigene ImmunexImmunexBedexBedex Laboratories LaboratoriesMerkMerkSmithKlin

14、eSmithKline Beecham BeechamMedevaMedeva PharmaPharmaCytogenCytogenMed ImmuneMed ImmuneRocheRocheIsis PharmaceuticalsIsis PharmaceuticalsSanofi-SythelaboSanofi-Sythelabo（安进）（安进）创建于创建于1980年，位于美国加洲年，位于美国加洲ThousandOaks，靠近加州大学和加洲理工学院。起初由于无产品上市，于，靠近加州大学和加洲理工学院。起初由于无产品上市，于1983，1986，1987通过公开发行股票募集资金维持公司生存。通

15、过公开发行股票募集资金维持公司生存。美国美国Nasdaq股票市场代号为股票市场代号为AMGN。20世纪后世纪后10年是生物技术飞速发展的年是生物技术飞速发展的10年，年，1989年年6月该公司月该公司第一个产品第一个产品重组人红细胞生成素重组人红细胞生成素(erythropoietin，简称，简称EPO)获获得美国得美国FDA批准，用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和批准，用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和HIV感染治疗的贫血感染治疗的贫血1991年年2月公司第二个产品月公司第二个产品重组粒细胞集落刺重组粒细胞集落刺激因子激因子(filgrastim，G-CSF)获得美国获得美国FDA批准，其适

16、应证为肿批准，其适应证为肿瘤化疗引起的嗜中性白细胞减少症。瘤化疗引起的嗜中性白细胞减少症。1992年安进公司首次跻身年安进公司首次跻身财富财富500强。此外强。此外,还有白细胞介素还有白细胞介素1受体拮抗剂受体拮抗剂Kineret和抗类和抗类风湿性关节炎融合蛋白风湿性关节炎融合蛋白Enbrel等。等。公司致力于研发新的蛋白药物，应用于肿瘤、炎症、骨疾病、公司致力于研发新的蛋白药物，应用于肿瘤、炎症、骨疾病、神经疾病、代谢性疾病和肾脏疾病的治疗。神经疾病、代谢性疾病和肾脏疾病的治疗。三个先驱生物制药公司Amgen,Biogen和Gennentech Biogen是全球老牌生物技术公司之一，始建于

17、是全球老牌生物技术公司之一，始建于1978年，年，并于并于2003年与制药公司年与制药公司Idec合并组建成合并组建成BiogenIdec公司。公司。总部位于美国麻省，在总部位于美国麻省，在欧欧洲，洲，加拿大加拿大，澳大利亚澳大利亚和和日本日本有分支机构。主要研发癌症，精神病，皮肤病和风湿病相有分支机构。主要研发癌症，精神病，皮肤病和风湿病相关药物。关药物。主要品种是老药主要品种是老药Avonex（野生型（野生型干扰素，适应症为多干扰素，适应症为多发性硬化症）和发性硬化症）和Rituxan（与（与Genentech共同研发的瞄准癌共同研发的瞄准癌细胞蛋白质的单克隆抗体药物，它可以挑选出癌细胞，

18、交细胞蛋白质的单克隆抗体药物，它可以挑选出癌细胞，交给免疫系统摧毁，适应症为肿瘤。给免疫系统摧毁，适应症为肿瘤。）。）。2005年，新药年，新药Tysabri（人源化单抗，适应症为多发性（人源化单抗，适应症为多发性硬化症）因安全问题撤市使股价受重大打击，从硬化症）因安全问题撤市使股价受重大打击，从70美元下美元下跌至跌至35美元美元/股左右。股左右。2006年，年，Tysabri因疗效确实，在严因疗效确实，在严格限制下重返市场，现有格限制下重返市场，现有17000名患者使用该药，没有再名患者使用该药，没有再发现致命和严重副作用。发现致命和严重副作用。Genentech(基因技术公司基因技术公司

19、美国历史最久美国历史最久的生物技术公司，规模和实力仅次于安进。它成立于的生物技术公司，规模和实力仅次于安进。它成立于1976年。创始人是风险投资家罗伯特年。创始人是风险投资家罗伯特.斯万森斯万森(RobertAswanson)和生物化学家赫伯特和生物化学家赫伯特玻意尔博土玻意尔博土(DrHerbertBoyer)。70年代早期，玻意尔年代早期，玻意尔(Boyer)和遗传学家史丹尼和遗传学家史丹尼科恩科恩(StanleyCohen)开创了开创了个名为个名为DNA重组技术的科学新重组技术的科学新领域。斯万森领域。斯万森(Swanson)为这一突破激动不已，他打电为这一突破激动不已，他打电话给玻意

20、尔请求会晤。玻意尔同意给这位年轻的创业者话给玻意尔请求会晤。玻意尔同意给这位年轻的创业者十分钟的时间。斯万森对这一技术的热心和对其商用前十分钟的时间。斯万森对这一技术的热心和对其商用前景的坚定信念是富有感染力的，会晤由景的坚定信念是富有感染力的，会晤由10分钟延长到了分钟延长到了3个小时：其结果是，基因工程技术公司宣布诞生个小时：其结果是，基因工程技术公司宣布诞生。1980年，基因技术公司上市，一个小时内每股从年，基因技术公司上市，一个小时内每股从35美元剧涨至美元剧涨至88美元，公司的身价因此激增至美元，公司的身价因此激增至3500万美无。这一事件是美国股市涨幅最大的案例之一万美无。这一事件

21、是美国股市涨幅最大的案例之一。上市有上市有10个基因工程药物，其中包括个基因工程药物，其中包括:人生长激素人生长激素“Nutropin”,抗体药物抗体药物“Herceptin”和和“Rituxan”,溶栓药物溶栓药物“Activase”和和“TNKase”.该公司目前处于临床试验阶段的还有该公司目前处于临床试验阶段的还有20个左右的产个左右的产品品基因工程公司作为美国最早和最大的生物技术类基因工程公司作为美国最早和最大的生物技术类风险投资支持的企业，代表着美国生物医学产业未风险投资支持的企业，代表着美国生物医学产业未来的发展的方向，同时也为世界风险投资事业的发来的发展的方向，同时也为世界风险投

22、资事业的发展提供了新的思路展提供了新的思路人类终于有了第一个转基因人类终于有了第一个转基因动物生产的药物上市用于临床。动物生产的药物上市用于临床。该药品从经过基因修饰奶山羊该药品从经过基因修饰奶山羊分泌出的羊奶中提取纯化，是分泌出的羊奶中提取纯化，是用于治疗一种被称为遗传性抗用于治疗一种被称为遗传性抗凝血酶缺乏症的疾病。这种药凝血酶缺乏症的疾病。这种药物的上市标志着转基因动物药物的上市标志着转基因动物药物真正迈入产业化时代。物真正迈入产业化时代。2009年年2月月6号美国号美国FDA批准了首个利用批准了首个利用转基因山羊生产的重组药物转基因山羊生产的重组药物Atryn（由美国（由美国麻省生物技

23、术公司麻省生物技术公司 GTCBiotherapeutics生生物技术公司）上市。物技术公司）上市。第五节第五节 发展前景发展前景医药生物工程一直是生物工程技术中发展最医药生物工程一直是生物工程技术中发展最快、最活跃的领域，也是各国生物工程研究开快、最活跃的领域，也是各国生物工程研究开发的重中之重，是生物工程产业最为成熟，竞发的重中之重，是生物工程产业最为成熟，竞争最为激烈的领域。近年来，争最为激烈的领域。近年来，基因组学、蛋白基因组学、蛋白质组学、生物信息学、转基因技术、干细胞和质组学、生物信息学、转基因技术、干细胞和克隆技术、生物芯片技术克隆技术、生物芯片技术等一系列新兴技术的等一系列新兴

24、技术的发展，为促进医药产业的发展提供了新的途径发展，为促进医药产业的发展提供了新的途径和思路，医药生物工程技术正在成为整个医药和思路，医药生物工程技术正在成为整个医药产业发展最重要的技术推动力。所以生物工程产业发展最重要的技术推动力。所以生物工程医药产业依旧是朝阳产业。医药产业依旧是朝阳产业。第二章第二章 基因工程与蛋白质工程基因工程与蛋白质工程 基基因因工工程程是是指指在在分分子子水水平平上上按按照照人人们们的的设设计计方方案案将将DNA片片段段（目目的的基基因因）插插入入载载体体DNA分分子子（如如质质粒粒、病病毒毒等等），从从而而实实现现DNA分分子子体体外外重重组组，产产生生新新的的自

25、自然然界界从从未未有有过过的的重重组组DNA分分子子，然然后后再再将将之之引引入入特特定定的的宿宿主主细细胞胞进进行行扩扩增增和和表表达达，使使宿宿主主细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传性性状状的的技技术术。基基因因工工程程有有时时也也称称为为重重组组DNA技技术术或或分分子子克克隆隆技技术。术。Genetic Codon一、基因工程的概念及其基本过程一、基因工程的概念及其基本过程 典型的主要步骤有：典型的主要步骤有：1、目的基因目的基因(靶基因靶基因)的制备；的制备；2、载体的选择与制备；载体的选择与制备；3、目的基因与载体的连接；目的基因与载体的连接；4、将将重重组组DNA分分子子转转入入宿

26、宿主主细细胞胞，并并在在其其中中进行复制、扩增；进行复制、扩增；5、重组子的筛选与鉴定；重组子的筛选与鉴定；6、表达产物的鉴定；表达产物的鉴定；7、工程菌（细胞）的大规模培养；工程菌（细胞）的大规模培养；8、表达产物的分离与纯化。表达产物的分离与纯化。Cloning into a plasmid基因工程必备的四个工具基因工程必备的四个工具1.工具酶工具酶2.载体载体3.目的基因目的基因(靶基因靶基因)4.宿主细胞宿主细胞二、工具酶二、工具酶1.限制性内切酶（限制性内切酶（restrictionendonucleases）：是一：是一类能识别双链类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的分子中特异

27、核苷酸序列的DNA水水解酶。这类酶的发现和应用促进了解酶。这类酶的发现和应用促进了DNA序列测定和序列测定和基因工程技术的发展。它们已成为分子生物学研究基因工程技术的发展。它们已成为分子生物学研究和基因工程技术中不可或缺的工具酶。和基因工程技术中不可或缺的工具酶。1968年，科学家年，科学家E.Smith首次从大肠杆菌首次从大肠杆菌K12和和K13中提取出了限制性内切酶。由于它们能够在中提取出了限制性内切酶。由于它们能够在DNA上寻找特定的切点，然后进行上寻找特定的切点，然后进行交错交错或或平齐平齐切割，切割，因此又称作因此又称作“分子剪刀分子剪刀”，迄今已发现，迄今已发现400多种。多种。现

28、在基因工程技术中所使用的限制性内切酶几乎都现在基因工程技术中所使用的限制性内切酶几乎都已商品化，在各生物技术公司（如国内的华美、美已商品化，在各生物技术公司（如国内的华美、美国的国的Promega等公司）都能购买到。等公司）都能购买到。限制型内切酶的命名限制型内切酶的命名 为了对这些酶进行合理地命名，为了对这些酶进行合理地命名，H.O.Smith和和D.Nathans于于1973年提出了限制性内切酶的命名规年提出了限制性内切酶的命名规则：（则：（1）取该酶的产生菌的）取该酶的产生菌的属名属名的第一个大写字的第一个大写字母和母和种名种名的第一、二个小写字母组成酶基本名称；的第一、二个小写字母组成

29、酶基本名称；（2）若具有不同株，取其株系的第一个字母加于）若具有不同株，取其株系的第一个字母加于酶名称之后，需大写；（酶名称之后，需大写；（3）若同一株中发现多种）若同一株中发现多种内切酶则用大写罗马字码内切酶则用大写罗马字码I、II、III、IV表示分离表示分离次序先后。以下是几种常见内切酶的命名情况次序先后。以下是几种常见内切酶的命名情况限制型内切酶的性质限制型内切酶的性质基基因因工工程程技技术术中中使使用用的的酶酶属属于于II型型限限制制性性内内切切酶酶，它它一一般般具具有以下特性：有以下特性：识识别别序序列列：大大多多数数酶酶的的识识别别序序列列为为4-6个个双双重重对对称称（回回文文

30、结结构）的核苷酸，少数酶识别更长的序列。构）的核苷酸，少数酶识别更长的序列。切割方式：切割方式：（1）在对称轴两侧相对的位点上，）在对称轴两侧相对的位点上，交错切割交错切割，形成带有，形成带有1到到4个核苷酸长度的个核苷酸长度的5，端端突出或突出或3，端端突出的突出的粘性末端粘性末端。所谓粘性。所谓粘性末端是指含有几个核苷酸单链的末端，可通过粘性末端碱基互末端是指含有几个核苷酸单链的末端，可通过粘性末端碱基互补，使不同的补，使不同的DNA片段发生退火，有利于连接酶的连接。片段发生退火，有利于连接酶的连接。（2）在识别序列双重对称轴上同时切割双链，产生平齐末端）在识别序列双重对称轴上同时切割双链

31、产生平齐末端或钝端。以下是几种典型的限制性酶的识别序列与切割方式。或钝端。以下是几种典型的限制性酶的识别序列与切割方式。5端突出3端突出平齐末端反应条件：反应条件：（1）一般限制性内切酶的最适反应温）一般限制性内切酶的最适反应温度为度为37,但也有例外，如但也有例外，如Sma则为则为25。（2）不同限制性内切酶反应所需的离）不同限制性内切酶反应所需的离子强度也不一样，一般分高、中、低三子强度也不一样，一般分高、中、低三种。在进行操作时可供应商所提供的反种。在进行操作时可供应商所提供的反应体系与反应温度进行。应体系与反应温度进行。同裂酶与同尾酶同裂酶与同尾酶同同裂裂酶酶（isoschizome

32、r）：又称异源同工酶，指不同来源但识别和切割序列完全相同的限制性内切酶。如HpaII和MspI(CCGG)；不不完完全全同同裂裂酶酶：指识别序列相同，但切割位点不同的酶，如SmaI（CCCGGG）和Xma I（CCCGGG）；同同尾尾酶酶：来源及识别序列均不相同，但切割后行成的限制性片段具有相同粘性末端的，当它们消化后产生的片段互相连接后，这两种酶的识别序列一并消失。如：Sal I（GTCGAC）和Xho I(CTCGAG)Sal ISal I片段片段 XhoXho I I片段片段 5 5，G G，+TCGAG 3TCGAG 3，3 3，CAGCT CAGCT C 5C 5，5 5，G GTC

33、GAGTCGAG 3 3，3 3，CAGCTCAGCTC C 5 5，星号活力（第二活力）星号活力（第二活力）迄迄今今所所发发表表的的第第II型型限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别序序列列都都是是在在一一定定消消化化条条件件下下测测出出的的，当当条条件件改改变变时时，酶酶的的专专一一性性可可能能会会降降低低，以以至至同一种酶可识别和切割更多的位点。同一种酶可识别和切割更多的位点。如如EcoRI通通常常只只识识别别GAATTC，但但是是在在低低盐盐（50nM），高高pH（8）和和甘甘油油存存在在的的条条件件下下，EcoRI识识别别序序列列与与原原来来不不同同，产产生生EcoRI星星号号酶酶活活

34、除除中中间间四四个个碱碱基基A不不能能变变成成T、T不不能能变变成成A外外，识识别别序序列列的的6个个碱碱基基位位置置上上仅仅在在一一处处与与原原来来序序列列不不同同的的任任何何一一个个碱碱基基的的替替代代，EcoR I照照旧旧能能识识别别此此序序列列（如如GAATTA，AAATTC，GAGTTC等等）。因因而而EcoRI的的识识别别序序列列在在DNA上上出出现现的的频频率率要要比比EcoRI识识别别序序列列的的出出现现频频率率高高15倍倍。此此外，外，BamHI也有类似情况。也有类似情况。因此，为了获得一种限制性内切酶的最适反应速度和理想的消因此，为了获得一种限制性内切酶的最适反应速度和理

35、想的消化专一性，必须坚持应用推荐的反应条件化专一性，必须坚持应用推荐的反应条件。酶的储存酶的储存纯化后的限制性内切酶酶制剂，通常储存在含纯化后的限制性内切酶酶制剂，通常储存在含有有50%甘油的缓冲液中，保存于甘油的缓冲液中，保存于-20，不会冰，不会冰冻，一般可储存一年以上。储存酶的温度不能过冻，一般可储存一年以上。储存酶的温度不能过低，若低于低，若低于-20，可使，可使50%甘油冰冻，而反复甘油冰冻，而反复冻融会导致酶严重失活。保存酶液的缓冲体系，冻融会导致酶严重失活。保存酶液的缓冲体系，不同的酶略有差异不同的酶略有差异,但不外呼是但不外呼是50-100mMKCl即即100mMTris-HC

36、lpH7.5,0.1mMEDTA,1mMDTT，同时加入同时加入BSA浓度至浓度至100-200g/ml,以保护以保护酶蛋白不失活。所用酶蛋白不失活。所用BSA质量要求很高，一定不质量要求很高，一定不能含有核酸酶类的活性。能含有核酸酶类的活性。酶活力单位的定义酶活力单位的定义在在50l缓冲液中，于最适反应条件和温度下保缓冲液中，于最适反应条件和温度下保温温1小时，能将小时，能将1gDNA完全降解所需的酶量即为完全降解所需的酶量即为1个酶活单位。个酶活单位。需要说明的是，所谓一个酶单位降解需要说明的是，所谓一个酶单位降解1gDNA是指在测活时所用的特定反应体系和是指在测活时所用的特定反应体系和D

37、NA种类下种类下完成的，若盐浓度、完成的，若盐浓度、pH等因素，尤其是等因素，尤其是DNA的种的种类改变后，并不一定一个酶单位还能完全消化类改变后，并不一定一个酶单位还能完全消化1gDNA。如，降解如，降解1g的的pBR322所用的酶量要大所用的酶量要大于水解于水解1gDNA所用的酶量。所用的酶量。2T4DNA连接酶连接酶 基基因因工工程程最最常常用用的的连连接接酶酶是是T4DNA连连接接酶酶（T4DNAligase）,它它可可将将两两段段乃乃至至数数段段DNA片片段段拼拼连连起起来来，起起到到分分子子“缝缝合合”的的作作用用。该该酶酶是是从从T4噬噬菌菌体体感感染染的的E.coli中中分分离

38、离得得到到的的分分子子量量为为68KDa的的单单链链多多肽肽酶酶，它它可可催催化化一一个个DNA片片段段的的3羟羟基基和和另另一一个个DNA片片断断的的5磷磷酸酸基基团团之之间间形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，连连接接时时需需要要ATP为为辅辅助助因因子子。该该酶酶既既可可连连接接粘粘性性末末端端，也可连接齐平末端，是应用最广泛的连接酶。也可连接齐平末端，是应用最广泛的连接酶。T4DNA连连接接酶酶最最适适反反应应温温度度为为37，但但为为了了增增强强两两段段DNA片片段段粘粘性性末末端端互互补补碱碱基基之之间间形形成成氢氢键键的的稳定性，实际反应温度一般为稳定性，实际反应温度一般为415。其它

39、常用修饰酶其它常用修饰酶DNA聚合酶聚合酶分分子子克克隆隆中中经经常常会会使使用用各各种种DNA聚聚合合酶酶，从从而而在在有有模模板板存存在在时时催催化化合合成成与与模模板板序序列列互互补补的的DNA产产物物。常常用用的的DNA聚聚合合酶酶有有大大肠肠杆杆菌菌聚聚合合酶酶，大大肠肠杆杆菌菌DNA聚聚合合酶酶大大片片段段（Klenow 片片断断）、T4DNA聚聚合合酶酶，T7DNA聚聚合合酶酶，耐耐高高温温的的DNA聚聚合合酶酶（如如TaqDNA聚聚合合酶酶）,反反转转录录酶酶等等等等。不不同同种种类类的的DNA聚聚合合酶酶来来源源不不同同，酶酶学学特特性性及及用用途途也也各各异异，其其应应用用

40、涉涉及及到到DNA分分子子的的体体外外合合成成，定定点点突突变变，DNA探探针针的的标标记记，DNA序序列列测测定定，基基因因文文库库的的构构建建，聚聚合合酶酶链链反反应应（PCR）等等等等诸多方面。诸多方面。T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 该该酶酶可可催催化化ATP的的磷磷酸酸基基团团转转移移到到DNA或或RNA的的5一一OH上上。可可分分为为正正向向反反应应及及交交换换反反应应。该该酶酶的的一一个个用用途途是是用用同同位位素素标标记记DNA片片段段的的5末末端端，反反应应底底物物包包括括化化学学合合成成的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段的的5一一OH和和DNA酶酶切切所所得得的的5粘粘端端或或平平

41、端端，后后者者必必须须先先用用碱碱性性磷磷酸酸酯酯酶酶去去除除5一一P，再再加加上上P，这这种种方方法法不不适适用用于于3粘粘端端。另另一一用用途途是是在在化化学学合合成成的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段的的5一一OH上上加加上上磷磷酸酸基基团，以便进行化学合成基因的拼连。团，以便进行化学合成基因的拼连。碱性磷酸酶碱性磷酸酶 包括细菌碱性磷酸酶包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和牛小肠碱性磷酸酶和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)，其作其作用是去除用是去除DNA、RNA、NTP和和dNTP的的5磷酸根。在基因克隆磷酸根。在基因克隆时可用于去除载体时可用于去除载体DNA片断的片断的5P，以防载体自身环化；此以防载

42、体自身环化；此外，在用外，在用32PATP对基因探针进行对基因探针进行5进行标记前，可用该酶去进行标记前，可用该酶去除其除其5磷酸基团。磷酸基团。基因工程载体基因工程载体目目的的基基因因（靶靶基基因因）必必须须与与载载体体DNA重重组组后后才才能能导导入入宿宿主主细细胞胞并并进进行行扩扩增增和和表表达达，从从而而获获得得大大量量的的目目的的基基因因克克隆隆以以及及表表达达产产物物。这这种种可可将将外外源源DNA载载入入宿宿主主细细胞胞的的工工具具便便称称为为载载体体（vector）。）。一一般般作作为为基基因因工工程程载载体体需需要要满满足足以以下下条条件件：1、能能在在宿宿主主细细胞胞中中独

43、独立立复复制制繁繁殖殖；2、有有一一定定的的选选择择标标记记，易易于于识识别别和和筛筛选选；3、可可插插入入一一段段较较大大的的外外源源DNA，而而不不影影响响其其自自身身的的复复制制；4、有有合适的限制性内切酶酶切位点，以便进行合适的限制性内切酶酶切位点，以便进行DNA重组与克隆。重组与克隆。目前基因工程载体主要有三类：目前基因工程载体主要有三类：质粒：质粒：各种质粒，用于基因克隆与表达；各种质粒，用于基因克隆与表达；噬菌体：噬菌体：噬菌体、粘粒、噬菌体、粘粒、M13噬菌体等；噬菌体等；病毒：病毒：SV40等。等。质粒质粒质粒质粒DNA是微生物细胞中分子量比染色体是微生物细胞中分子量比染色体

44、DNA小小得多的共价、闭合、环状双链得多的共价、闭合、环状双链DNA分子（个别除外，分子（个别除外，如酵母自杀质粒是如酵母自杀质粒是RNA），），是一种存在于染色体外是一种存在于染色体外的能自主复制的遗传因子，质粒通常带有与细胞的的能自主复制的遗传因子，质粒通常带有与细胞的主要代谢活动无关的一些基因，例如抗生素抗性基主要代谢活动无关的一些基因，例如抗生素抗性基因，产生细菌素的基因，碳水化合物分解代谢的基因，产生细菌素的基因，碳水化合物分解代谢的基因和诱发肿瘤的基因等等。由于质粒的存在，宿主因和诱发肿瘤的基因等等。由于质粒的存在，宿主细胞往往被赋予新的表型，当把一个含抗药性基因细胞往往被赋予新的

45、表型，当把一个含抗药性基因的质粒转入细胞之后，原来无抗药能力的细菌则表的质粒转入细胞之后，原来无抗药能力的细菌则表现出抗药新表型。现出抗药新表型。质粒的生物学性质质粒的生物学性质(1)质粒的复制质粒的复制具备复制起点（原点）是具备复制起点（原点）是DNA分子在宿主细胞中分子在宿主细胞中进行复制的一个必要条件。根据复制控制类型的不进行复制的一个必要条件。根据复制控制类型的不同质粒分为严紧型质粒与松弛型质粒，前者受宿主同质粒分为严紧型质粒与松弛型质粒，前者受宿主细胞复制作用的严格控制，因此，每个细胞中只含细胞复制作用的严格控制，因此，每个细胞中只含有一至几个拷贝；而后者则受宿主细胞的控制不严，有一

46、至几个拷贝；而后者则受宿主细胞的控制不严，它们在每个细胞中的数目可达它们在每个细胞中的数目可达10-500个拷贝，当用个拷贝，当用氯霉素抑制细胞蛋白质合成时，质粒拷贝数可扩增氯霉素抑制细胞蛋白质合成时，质粒拷贝数可扩增至数千个。现在使用的质粒载体绝大多数都是松弛至数千个。现在使用的质粒载体绝大多数都是松弛型质粒。型质粒。（2）质粒不相容性（）质粒不相容性（incompatibility)指指在在没没有有选选择择压压力力的的条条件件下下，两两种种亲亲源源关关系系密密切切的的质质粒粒不不能能共共存存于于同同一一宿宿主主细细胞胞中中的的现现象象。原原因因是是它它们们的的复复制制子子相相同同，所所用用

47、的的复复制制系系统统也也相相同同，故故在在复复制制和和分分配配到到字字细细胞胞的的过过程程中中互互相相竞竞争争。细细菌菌生生长长几几个个世世代代后后，量量少少的的质质粒粒就就完完全全消消失失。至至今今已已发发现现30个个以以上上的的不不相相容容组组，只只有有属属于于不不同同不不相相容容组组中中的的质质粒粒才才能共同存在于同一个宿主细胞中。能共同存在于同一个宿主细胞中。（3）选择标记）选择标记当当质质粒粒DNA转转化化宿宿主主细细胞胞时时，只只有有极极少少部部分分宿宿主主细细胞胞接接受受了了DNA，所所以以需需要要利利用用质质粒粒编编码码的的选选择择标标记记将将转转化化成成功功的的宿宿主主细细胞

48、阳性克隆）从大量的宿主细胞中筛选出来。胞（阳性克隆）从大量的宿主细胞中筛选出来。质粒最常用的选择标记是抗生素抗性基因，这些抗性主要包质粒最常用的选择标记是抗生素抗性基因，这些抗性主要包括氨苄青霉素（括氨苄青霉素（Amp或或Ap）、）、四环素四环素(Tet)、氯霉素氯霉素(Cm)、卡卡那霉素那霉素(Kan或或Km)和新霉素（和新霉素（Neo）等。例如，对氨苄青霉素有等。例如，对氨苄青霉素有抗性的质粒，一般写作抗性的质粒，一般写作Apr；而对该药敏感的质粒则写作而对该药敏感的质粒则写作Aps。常见质粒载体常见质粒载体由由于于野野生生质质粒粒往往往往存存在在许许多多不不足足，因因此此现现在在使使用

49、用的的质质粒粒载载体体一一般般都都是是人人工工构构建建的的，从从而而使使其其满满足足以以下下条条件件：1、其其分分子子结结构构中中带带有有多多个个单单一一限限制制酶酶切切位位点点，2、构构建建后后的的重重组组质质粒粒必必须须易易于于转转化化；3、带带有有一一个个以以上上强强选选择择性性标标记记；4、分分子子量量较较小小，属属松松弛弛型型复制控制，便于操作；复制控制，便于操作；5、宿主范围小，无感染性。、宿主范围小，无感染性。pUC系列载体是目前应用较广的一组可用于克隆、系列载体是目前应用较广的一组可用于克隆、测序和表达外源基因的非常有用的载体系列。这类测序和表达外源基因的非常有用的载体系列。这

50、类载体具有以下特征：（载体具有以下特征：（1）、高拷贝数，每个宿主细）、高拷贝数，每个宿主细胞中拷贝数可达胞中拷贝数可达500-700个；（个；（2）、在相应的宿主）、在相应的宿主中可出现中可出现互补，便于进行蓝、白斑筛选；（互补，便于进行蓝、白斑筛选；（3）、）、pUC系列载体是成对出现的，它们之间除多克隆位系列载体是成对出现的，它们之间除多克隆位点排列方向相反外，其它并无区别。点排列方向相反外，其它并无区别。2007/10/10噬菌体噬菌体结构与性质结构与性质噬噬菌菌体体分分头头部部和和尾尾部部，其其DNA存存在在于于头头部部，当当其其尾尾部部附附着着在在大大肠肠杆杆菌菌宿宿主主表表面面时