细胞凋亡的检测方法汇总.docx

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1、细胞凋亡的检测方法汇总一、形态学检测(一)光学显微镜和倒置显微镜1、未染色细胞凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。2、染色细胞常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。(二)荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：Ho33342(Hoechst33342),HO33258(Hoechst33258),DAPIo三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区

2、紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hocchst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馀水配成1.mgm1.的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为25mgm1.DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸储水配成1.mgm1.的浓度，使用终浓度一般为051.mgm1.结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:I期的细胞核呈波纹状(ripp1.ed)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态：Ha期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；IIb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(三)透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，表面微绒毛消失，细胞质浓缩。凋亡1期(P

3、rO-apoptosisnuc1.ei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象(CaVitatiOnS)的空泡结构，：I1.a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。二、DNA凝胶电泳(一)琼脂糖凝胶电泳凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180200bpDN片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。1、常规的琼脂糖凝胶电泳方法一Westernb1.ot分析PrOCaSPaSe-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶po1.y(ADP

4、ribose)po1.ymerasePARP等的裂解。(1)收集细胞(5106)1000rmin,离心5min,去上清。(2) PBS洗一次，100ormin,离心5min,去上清。(3)加细胞核裂解液500U1.重悬细胞，50C水浴，35h,不时振摇或37C过夜。(4)加0.5IDI平衡酚抽提,上下颠倒几次混匀,6000rmin,离心5min(5)上清移至另一EP管,加0.5m1.氯仿：异戊醉抽提,上下颠倒几次混匀,6000rmin,离心5miru(6)上清移至另一Bp管,加501的3mo1.1.乙酸钠和2m1.预冷无水乙醇，上下颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。(7)置液氮5IOmin,

5、12000rmin离心IOnIin沉淀DNA,去上清，真空抽干或风扇下吹干残存液体。(8)加50-1001.TE缓冲液,另加5U1RNaSe,37C水浴30min(9)取20U1.加上样缓冲液25M,1%琼脂精凝胶电泳(电压50V,1.52h),UV下观察。方法二(1)离心收集细胞(5106),PBS(无Ca2+和Mg2+)洗12次。(2) 0.5m1.TBE溶液重悬，37C孵育30min(3) 1.mgm1.蛋白酶K37处理30min0(4)加入上样缓冲液OJm1.(5) 25U1.上样，1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，2Vcm6h.方法三(1)收集细胞悬液(106细胞)，低速离心(100Orm

6、in,离心5min)。(2)去上清，沉淀加04m1.低渗缓冲液作用Iho(3) 13000rmin,离心Iomin,将上清转移至另一Eppcndorf管中，加等量50%异丙醇和0.5mo1.1.NaC1.混匀,置液氮5min.(4) 12OOOrZmin,离心IOmin,弃上清，沉淀真空抽干。(5)加TE1001,65C加热IOmin,取20u1.,加H2口1上样缓冲液，电泳观察。方法四(1)收集细胞，100OrVmin离心5min,去上清。(2)用冰预冷的70%乙醇固定，可长期保存于一20。C冰箱。(3) 1000rmin离心5min,去除固定液,用约0.5m1.的PBS重悬细胞。(4)转入

7、EPPCndorf管中，同法离心，去上清。(5)细胞用40UIPC缓冲液重悬,室温3060min.(6) 100or6n离心5min,吸上清于新的EPPendOrf管中,真空浓缩15mino(7)加入0.25%NP-40溶液3m1,hng/m1.RNaseA溶液3u1,37C,30min(8)加入31.蛋白酶K,37,C,30mino(9)加入121样品稀释液,含漠化乙锭的1.5%琼脂糖电泳,观察2、琼脂糖凝胶电泳的定量检测方法一：简易末端标记法(1)按常规提取细胞DNA。(2)在0.5m1.的EP管中加入细胞DNA,反应体系如下:细胞DNA0.51.Oug,IoX缓冲液2u1.,32PYAT

8、P(或一dCTP)O.5UCi,K1.enow聚合W5U,双蒸水加至201.（3）混匀后稍加离心，室温反应30min0（4）加110.5mo1.EDTA终止反应。（5）常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次，无水乙醇沉淀DNA,真空抽干。（6）溶于20U1.的TE缓冲液中。（7）取标记DNA在1.8%琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2h。（8）电泳后的凝集置滤纸上烘干，进行放射自显影。方法二：5,末端32P标记法细胞DN的提取（1）细胞悬液离心后,沉淀加消化缓冲液0.5m1.50C35h,或37过夜。（2）用等体积的酚：氯仿：异戊醉抽提细胞裂解液。（3）将水相转移至新的试管,加入15OnImo1./1.乙

9、酸钠和10mmo1.1.氯化镁。加入2倍体积的预冷无水乙醇,置液氮5min或一20C12h.（5）12000rmin离心沉淀DNA,70%乙醇洗1次后,真空抽干。（6）溶于20U1.的TE缓冲液中。（7）加入终浓度为10gmRNase,37C,30min（8）同法用等体枳酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。（9）溶液20U1.的TE缓冲液中，一20C保存备用。DNA含量测定：用26Onm波长紫外分光光度计:吸光单位为20时约为1.mgm1.DNA0方法三：DNA5,末端脱磷酸(D取纯化的细胞DNAIog,然后加入：10XC1.P2I(IU),双蒸水加至50Io(2) 37C水浴2h。(3

10、) 9(C水浴5min以灭活CIP。(4)用等体积酚：氯仿：异戊醉抽提，乙醇沉淀，真空抽干。方法四：DNA5,末端32P标记(1)将脱磷酸样品DNA置冰浴上，再加双蒸水IoHI,IOX缓冲液2U1.,T4多核昔酸激酶10U,32P-ATP740kBq(20uCi),双蒸水加至20I。(2)混合后,37C水浴60min0(3)加入11的0.5mo1.1.EDTA,90C灭活5min观测(1)取一定量的标记DNA稀释后在1.8%琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2ho(2)电泳后的凝胶置滤纸上烘干，进行放射自显影。(3)含32P标记DNA电泳干凝胶进行同位素液闪测定，计算放射活性。结果判断：正常活细胞

11、INA电泳出现阶梯状(1.ADDER)条带：坏死细胞INA电泳类似血抹片时的连续性条带o三、床联免疫吸附法（E1.ISA）核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由E1.ISA法检测。（一）检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体：3、加上清夜使抗组蛋臼抗体与核小体上的组蛋白结合；4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合；5、加酶的底物,测光吸收制。（二）用途该法敏感性高，可检测5*1.00m1.个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作

12、但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、流式细胞仪定量分析（一）检测原理细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。（二）应用价值流式细胞仪检测具有以下特点：1、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2、可以做许多相关性分析3、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期(1)检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，

13、利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取HOeCha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙烷(PI)而呈强的红色荧光。(2)DXA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脱氧核甘酸转移的(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3的羟基(-0H)端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术

14、DNA聚合酶或K1.enow大片段介导的原位缺口平移(ISNT)切片常规脱蜡，梯度乙醉复水化。将切片组织浸入2XSSC液中，80C,20min,然后蒸储水冲尽。0.5%胃蛋白酶(pH2.O)37C消化020min,PBS洗尽。用滤纸擦干组织块周边液体放入湖盒组织切片上滴加缓冲液A,5miu缓冲液A：50mmo1.1.Tris-HCb5mmo1.1.MgC12,IOmnK)I/1.B-玉基乙醉,0.005%BSA,pH7.5。弃去缓冲液A,滴加标记液约501,25C温育Ih.标记反应液:0.00511mo1.1.dNTP,0.005mo1.1.biotin-16-d(JTP,25Um1.K1.

15、enow大片段。PBS漂洗2次,各3min.内源酶阻断剂阻断15min.PBS洗2次，各3min。滴加HRP-avidin覆盖组织，室温下30minoPBS洗2次，3minDAB-H202显色约5min。流水冲洗后，苏木素熨染Imin0常规脱水，透明，封片。阴性对照片在第5步改加不含K1enow的标记液,余同。TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNE1.)细胞凋亡中，染色体DN双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3,-OH末端，可在脱氧核糖核甘酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苛酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测

16、这类方法称为脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(termina1.-dcoxynucIeotidytransferasemediatednickend1.abe1.ing,TUNE1.)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNE1.实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研窕中被广泛采用。切片常规脱蜡，第水，

17、后续过程在湿盒内进行。3%的H202阻断内源性辣根过氧化物酶30min00.15mo1.1.的PBS洗2次,每次5min三切片浸泡在2XSSC80C20min。0.15mo1.1.的PBS洗2次,每次5min。蛋白酶K或胃蛋白酶消化。20nIirU0.1.5mo1.1.的PBS洗2次,每次5min0TdT缓冲液孵育IOmin0TdT反应液37C孵育1.h。切片浸泡在2XSSC溶液IOmin,以终止反应.0.15mo1.1.的PBS洗2次,每次5min.链卵白素标记的辣根过氧化物随孵育30mi11o0.15mo1.1.fi。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白

18、能与PS高亲和力特异性结合。将AnneXin-V进行荧光素（FrrC、PE）或biotin标记,以标记了的AnneXin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙鹿（propidineiodide,PD是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将AnneXin-V与P1.匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(nnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin

19、V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝宏酸。故利用对PS有高度亲和力的AnneXinV,将AnneXinV标记上荧光索(如异硫制酸荧光素FITC),同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对P1.高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。(1)方法悬浮细胞的染色将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(O.51X106)用PBS洗2次，加入100u1.BindingBuffer和FITC标记的Annexin-V(20ugm1.)IOub室温避光30min,再加入PI(50ugm1.)5u1.,避光反应5min后，加入4OOu1.BindingBuffer,立即用FA

20、CSCan进行流式细胞术定量检测(一般不超过Ih),同时以不加AnneXinV-F1.TC及P1.的一管作为阴性对照。贴壁培养的细胞染色先用0.25%的胰醯消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。爬片细胞染色同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。(2)注意事项整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。(3)结果判断正常活细胞AnneXinWPI均低染；凋亡细胞AnnCXinV高染、P低染；坏死细胞AnneXinV/PI均高染。(4)应用价值细胞发生凋亡时,膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnneXinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较

21、TUNE1.法更为灵敏。乂AnnexinV联合P1.染色不需固定细胞，可避免P1.染色因固定造成的细胞碎片过多及TUYE1.法因固定出现的DNA片段丢失。因此，AnnCXinV联合PI法更加省时，结果更为可嵬，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法五、线粒体膜势能的检测线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体DYmI崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodaminc123、3,3-Dihexy1.oxacarbocyanineiodidcDiOC6(3

22、)、Tetrech1.oro-tetraethyIbenzimidazo1.carbocyanineiodidejC7、Tetramethy1.rhodaminemethy1.ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。(一)方法将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine123(ImM)或终浓度为DiOC6(25nM),JC-I(ImM),TMRM(100nM),37C平衡30min,流式细胞计检测细胞的荧光强度。(二)注意事项1、始终保持平衡染液中PH值的一致性，因为PH值的变化将影响膜电位。2、与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。