标准曲线使用过程中的难点和误区.docx

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1、标准曲线使用过程中的难点和误区在分析检测领域，标准曲线的应用已成为常规操作。为深入探讨标准曲线使用过程中的难点与误区，本文将以讲解结合问答的形式展开，并融入数据处理板块中关于标准曲线的问题交流，旨在答疑解惑、助力共同提升。1、标准曲线的本质在分析检测工作中，标准曲线用于表征一系列已知含量（浓度/量）的物质与其对应的仪器响应信号之间的关联。这种关联可通过数学方法提炼为曲线方程，也能以直观的图形形式呈现，统称为标准曲线。其核心功能在于通过标准曲线推导待测物质的含量：当获取已知含量物质的响应数据后，需建立两者的函数关系一一这一过程在数学中称为曲线拟合。由于直线方程具有形式简洁、计算便捷的优势，*线性

2、拟合（直线方程）*成为最常用的方法;但在非线性响应场景下，也会采用多项式拟合等其他方式。标准曲线的核心问题要解决：1、标准物质的精准性，即确保所使用的标准物质或标准品具有明确且准确的浓度；2、基体匹配的必要性，由于样品基体可能对仪器响应产生干扰，因此标准系列必须与待测物质保持基体一致性。从这个角度来看，样品前处理的关键任务，就是创造一个让标准品和样品处于相同基体环境的条件，尽可能消除干扰因素。由此可见，与样品基体高度匹配的标准系列，才是理想之选。在方法开发阶段，基体干扰是首要考量因素。建议采用标准加入曲线和Youden曲线，分别对样品基体引发的乘积性干扰和加和性干扰进行深入分析，从而为精准检测

3、奠定基础。在分析检测过程中，为解决基体干扰对标准曲线的影响，有两种实用的评估方法及对应的解决方案：标准加入曲线：将一系列不同浓度的标准物质添加至同一份样品中，绘制“样品加标”的响应曲线。通过对比该曲线与常规标准曲线的斜率，进行统计学分析。若两者斜率存在显著差异，意味着样品基体可能产生乘积性干扰，导致响应灵敏度改变，此时建议采用标准加入法定量，以此修正干扰带来的误差。Youden曲线：将样品按不同比例（如1/10、1/5、1/2等）进行稀释,以稀释倍数为横坐标，仪器响应值为纵坐标绘制曲线。重点观察曲线的截距与0之间的差异，若截距明显偏离0,表明存在加和性干扰,即背景信号对检测结果产生影响。在这种

4、情况下，需从原始测定值中减去该截距，才能得到真实的含量数据。要确保定量结果可靠，解决标准曲线与样品基体的匹配问题是关键。而内标法和替代物的应用，则是为了进一步消除仪器波动（如灵敏度变化）以及前处理过程（如提取效率差异）带来的误差，从而全方位提升分析检测的准确性和稳定性。2、标准曲线的做法GB/T22554-2010基于标准样品的线性校准有如下推荐内容：1 .标准曲线的浓度范围需涵盖正常操作条件下的被测量范围。2 .标准样品的组分应尽可能与被测样品的组分保持一致。3 .标准样品的浓度值要等距离地分布在被测量范围内。4 .标准样品的个数最少要有3个浓度。5 .每个标准点至少要重复2次，且该重复需从

5、稀释步骤开始。倘若国家标准针对浓度系列有相应的推荐，应尽量按照国家标准执行。若想减少标准点，例如偷懒少设置一些，那么至少需要有理论标准作为支撑，像前面提到的至少设置3个浓度点。在实际工作中,人们常常采用线性校准，这是因为线性方程最为简单便捷。3、标准曲线的检验标准曲线的检验在实际操作中是个难点，也是容易产生误区和争议的话题，像GB/T5750.3-2006就把标准曲线的检验分为精密度检验、截距检验和斜率检验，不过没有给出具体的检验方法。先来说说这三个检验中的精密度检验。它实际上是考察做出来的试验点在拟合的直线方程周围的分布状况。标准曲线是通过最小二乘算法（OLS）将所有点拟合而成的，该曲线到所

6、有点的垂直距离之和（即残差）最小。这意味着这条曲线并不是经过所有的点，而是与所有点非常接近。精密度检验就是查看这些试验点与拟合直线的距离是否存在异常，所以也被称作线性检验（拟合检验）。进行精密度（线性检验）时要使用F检验，当P0.05时，可判定线性检验合格。在标准曲线的分析中，截距检验与斜率检验主要探究的是线性方程Y=a+bX里的参数a和b与O之间是否存在统计学差异。具体来说，当截距a与O存在显著差异时,意味着实验中可能存在试剂空白干扰,或者出现了系统误差；而如果斜率b与O没有明显差异，那就表明仪器的灵敏度不足，无法满足当前的分析需求。在日常工作里，很多人习惯用相关系数来评判标准曲线的优劣,这

7、种做法有一定的合理性，但并不够全面。决定系数，也就是我们在仪器软件中常见的R2或Fit,它其实是相关系数的平方。决定系数反映的是所建立的回归方程能在多大程度上解释自变量X引起的因变量Y的变化。例如，若决定系数为099,就表示该回归方程能够解释Y变量99%的变化，剩下1%的变化则属于残差部分。前面提到的精密度检验（即线性检验），本质上就是依据回归方程可解释的变化部分与残差部分，通过F检验来判断数据点与拟合直线的契合程度。一般来说，由于统计检验的临界值较大，只要相关系数达到0.90以上，大多能通过F检验，但最终结果也会受到实验点数（即自由度）的影响。在标准曲线检验领域，GB/T22554-2010

8、基于标准样品的线性校准提出的失拟检验值得重点关注。失拟检验旨在对比曲线拟合后的残差与实验数据自身随机误差（变异）之间的差异，同样借助F检验来完成。在该检验中，理想的结果是P0.05,这表明残差与实验测定过程中的随机误差（变异）并无显著区别。由于随机误差（变异）需通过多次测定同一浓度来观察，所以失拟检验明确规定每个浓度点至少要重复测定2次。除了上述检验，还需进一步考察残差的分布形态是否符合正态分布。因为只有呈正态分布的残差，才契合随机误差的基本特性。由此可见，想要实现统计学意义上较为完备的标准曲线检验，必须将线性检验、失拟检验，以及残差的正态性检验有机结合。日常工作中，单纯以相关系数达到0.99

9、以上作为标准曲线合格的依据，其实在统计层面并不完备。例如，通过调整拟合参数个数，采用二次方程往往能显著提升相关系数，但实际应用时人们却很少贸然使用二次曲线方程，根源就在于缺乏统计学上的充分验证。另外，如果发现标准曲线在低浓度和高浓度点的变异程度存在差异（即非等方差情况），那么此时就需要考虑运用权重最小二乘（WLS）方法，来优化曲线拟合效果。4、标准曲线使用中的问题1、标准曲线需要人为的增加（0,0）点吗？不能、在标准曲线的构建过程中，能否人为添加（0,0）这一数据点呢？答案是否定的。一般而言，标准系列常以“0,1,2,3mgL这样的浓度梯度来配制，但在未实际开展实验的情况下，直接添加（0,0）

10、是不恰当的。实际操作中，即便浓度为0的样品进入检测仪器，也可能产生响应信号，而这一信号正是检测试剂空白的关键依据。以全血铅测定为例，为了实现基体匹配，往往会采用牛血清来配制标准系列。在这种情况下，如果使用酸作为空白，或者人为添加（0,0）数据点，极有可能导致标准曲线无法准确构建。由此可见，浓度为O的样品管在标准曲线制作中扮演着不可或缺的角色，是构建可靠标准曲线时必须慎重考量的重要环节。2、标准曲线需要减掉试剂空白来做吗？不需要。在制作标准曲线时，是否需要先减去试剂空白再进行操作呢？答案是不必如此。在实际检测中，仪器测定的标准系列响应值，既可以减去试剂空白的响应，也能扣除。管的响应，日常工作里，

11、也常见用O管响应值对仪器进行调零的做法。但实际上，这些额外步骤并非必要。即便试剂空白或。管存在响应信号，在构建标准曲线的过程中，我们默认该响应值对应的就是。浓度状态。也就是说，在拟合曲线时，这个“空白响应”已经被自动纳入考量，相当于完成了空白扣除的操作，无需再进行额外的减法处理。3、什么时候用Y=bX和二次曲线呢？在标准曲线的构建中，何时该选用Y=bX的直线方程，又何时适合采用二次曲线呢？一般情况下，我们常用Y=a+bx的线性方程来拟合标准曲线。不过，曲线拟合完成后，不能直接使用，必须进行全面的统计检验，包括线性检验和失拟检验，确保统计的完备性。止匕外，还需检验截距a与O是否存在显著差异。当统

12、计结果显示a与O没有统计学差异时，此时可以考虑改用Y=bX的形式重新拟合曲线。对新拟合的Y=bX曲线，同样要开展线性检验和失拟检验。只有当线性检验的P值小于0.05,且失拟检验的P值大于005,表明拟合效果良好，才可以采用Y=bX作为最终的标准曲线方程。对于二次曲线的选用，遵循类似的逻辑。如果使用Y=a+bX进行曲线拟合时，检验结果不理想，无法通过相关检验，这时可以尝试采用二次曲线方程Y=a+bX+cX2重新拟合。拟合完成后，依然要进行失拟检验，判断曲线对数据的拟合程度。如果Y=a+bX和Y=a+bX+cX2两种拟合方式都能通过拟合检验和失拟检验，根据统计学中参数最少的简洁性原则，应优先选择形

13、式更为简单的Y=a+bX方程来构建标准曲线。4、标准曲线去查含量时是先减空白信号算样品含量还是先算出空白含量相减呢？在利用标准曲线测定样品含量时，到底应该先减去空白信号再计算样品含量，还是先算出空白含量再与样品含量相减呢？这是实际工作中常遇到的问题。目前，不同的国家标准方法给出了不同建议：有的推荐先通过标准曲线算出空白含量，再用样品含量减去空白含量;也有的建议先用样品信号减去空白信号，再代入标准曲线推算样品含量。实际操作中，这两种计算方法得出的结果常常存在较大差异，尤其是在低含量样品的测定中更为明显。毕竟在低含量水平下，通过标准曲线推算含量本身就存在较大的不确定度。从理论上来说，这两种方法都可

14、行。不过，个人更倾向于先用样品信号减去空白信号，再依据标准曲线推算样品含量。这是因为这种计算方式引入的不确定度相对较小。相比之下，先计算空白含量再进行相减的方法，相当于在计算过程中多了一次通过标准曲线推算含量的步骤，这无疑会进一步增大最终结果的不确定度。在测量工作中，追求更小的不确定度才能实现更精准的测量，因此前一种方法更为可取。5、如何做两条标准曲线的检验？在标准曲线的分析工作中，经常会遇到需要判断两条或多条标准曲线是否存在差异的情况。从原理层面来看，判断的关键在于对残差、截距和斜率这三个指标进行检验，每个指标对应着不同的统计学检验方法：其中，残差通常采用F检验，而截距和斜率的检验则需要借助

15、更为复杂的统计量。从实际操作角度出发，协方差分析是检验截距和斜率差异的常用方法。以数据分析软件SPSS为例，具体操作步骤如下：1 .数据整理、首先需要对原始数据进行重新编排。将第二条标准曲线的因变量数据(y2)添加到第一条标准曲线因变量数据(yl)下方，合并为一个新的因变量y；同理，将第二条标准曲线的自变量数据(2)添加到第一条标准曲线自变量数据(l)下方，形成新的自变量x。同时，创建一个新的分组变量group,将第一条标准曲线对应的数据标记为L第二条标准曲线对应的数据标记为2。2 .斜率差异检验、进行协方差分析以判断两条曲线的斜率是否存在差异。具体操作路径为：依次点击【Analyze】Gen

16、eralLinearModelfUnivariate。在弹出的界面中，将因变量y填入DependentList；分组变量group填入FixedFactor；自变量x填入【Covariates】。接着在【Model】选项中选择【Custom】，并在【Model】框内依次填入“x”“groupxgroup（需注意，变量填入顺序会影响结果），同时将【Sumofsquares下拉列表框设置为【TypeIo完成设置后点击【ok，查看结果中“xgroup”这一行的Sig.P值。若P值大于0.05,说明两条回归直线的斜率无显著差异；反之，则表明斜率存在差异。3.截距差异检验、检验截距是否存在差异的操作流程

17、与斜率检验类似，唯一的区别在于【Model】设置。在【Model】框内仅需填入“x”和“group”,去掉“x*group”交叉项。其他设置保持不变，即因变量y仍填入【DependentList）,分组变量group填入【FixedFactor,自变量X填入Covariates,Sumofsquares下拉列表框选择TypeI】。点击ok后,查看结果中“group”一行的Sig.P值，若P值大于005,说明两条回归直线的截距无显著差异；若P值小于0.05,则表明截距存在显著差异。6、标准系列的标准溶液体积取用中有效数字该如何写呢？标准溶液体积取用的有效数字取决于所使用的体积量具。例如，“量取”

18、或“准确量取”等表述中，IOmL和10.OmL意味着要使用不同的量具。每次使用量具量取体积后，读数由量具的最小允差决定，而最小允差与最小分度线相关。以A级IOmL分度吸管取用IOmL体积为例，其分度线为0.ImL,所以应记为10.OmLo用A级ImL分度吸管取用IInL体积时,分度线为SOlmL,应记为LooInL。因此，是写10.00还是10.0应根据最小分度线确定，最小分度线以下为估读。如果将估读视为有效数字，10OOmL也是可以的，因为此时容量允差为0.05mLo不过，对于A级ImL的分度吸管，其容量允差为0.008mL,记录为LooOnIL就意义不大了。7、标准曲线的相关系数的有效数字

19、该如何保留呢？GB5750.3-2006的8.2.7项对标准曲线相关系数有效数字的保留有明确规定：采取只舍不入的原则，保留到小数点后出现非9的那一位。例如，0.99989应保留为0.9998。若小数点后的数字全是9,那么最多保留到小数点后4位。8、标准曲线可以用同一浓度不同体积的进样来做吗？标准系列通常采用配制不同浓度、进样相同体积的方式，即浓度法来制作标准曲线。不过在实际工作中，也会使用同一浓度但进样不同体积的方法，也就是体积法。浓度法和体积法存在一些区别。浓度法中，待测物质所处溶剂环境的体积基本保持一致，这使得在判断溶剂或溶剂中干扰物质与待测物质的指认时更加容易。而体积法中，干扰物质会随着

20、标准系列的变化而增加，不利于待测物质的指认。止匕外，使用进样针进小体积时，不确定度较大，导致体积法制作的标准曲线不如浓度法容易呈直线。并且由于物理体积的限制，体积法难以实现较大跨度的浓度系列设置。总体而言，体积法和浓度法在本质上是相同的，但浓度法具有容易做好标准曲线、容易实现较大浓度跨度以及容易实现待测物质指认等优点。9、标准曲线查出样品是负值，如何报告结果呢？在标准曲线查出样品为负值时，通常有以下四种报告结果的方式:未检出、检出限、定量限、标准曲线第一点所推算的样品浓度。这四种方式各有其合理性，也存在不同的报告风险。“未检出”若不明确界定是本实验室、本仪器、本方法未检出，容易产生歧义且无法提

21、供更多有效信息，因此一般不建议学生采用。检出限是定性检出的标志，通过与空白进行统计比较得出，计算方法有单浓度方法和校正设计法，目前多倾向于使用校正设计法，利用标准曲线直接计算，能将I类和11类错误控制在0.05。定量限则是可定量检出的标志，相对标准偏差（RSD）定为10%,其II类错误比检出限小。“标准曲线第一点所推算的样品浓度”是仪器较为可信的测定浓度。总体而言，报告检出限、定量限、标准曲线第一点所推算的样品浓度，所犯的I类和11类错误逐渐降低。不过，若报告结果超过要判断的限值，检测就失去了意义。所以，一些检测单位会直接报告小于国家标准规定的限值，从概率统计角度看，这样犯错几率最小，也能满足

22、客户的检测需求。10、空白测出来是负值，该不该减呢？空白值反映了所选空白对仪器响应或信号的影响，这种影响可能是正向的，也可能是负向的O从理论上来说,是必须要减去空白值的。至于具体是先减去空白信号，还是减去空白测定值，则需要参照国家相关规定来执行。11、线性范围（动态范围）的最低点和最高点如何确定呢？确定线性范围（动态范围）的最低点和最高点有以下方法：最高点确定配制一系列包含O浓度的标准浓度溶液，从低浓度开始进行拟合,当拟合检验出现P0.05时，此时对应的最高浓度点即为线性范围的最高点。也有经验表明，当高浓度点依据低浓度点构建的直线方程推算出的响应超出pml%范围时，该高浓度点可视为线性范围的最高点。最低点确定对于线性范围的最低点，存在是0、检出限或是定量限等不同观点。不过，由于线性范围主要是统计学上线性的体现，与能否准确定量属于不同方面的问题，所以个人倾向于将最低点确定为0。