胚胎植入前遗传学检测技术质量控制.docx

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1、胚胎植入前遗传学检测技术质量控制摘要随着胚胎植入前遗传学检测(preimplantationgenetictesting,PGT)技术应用规模不断扩大，分子遗传学检测技术在辅助生殖临床诊疗领域也得到了飞速发展和进步。PGT的稳定性、可靠性和有效性是后续胚胎精准筛选的重要保障，而实验室质量控制和管理是PGT临床应用必不可少的环节。PGT质量控制的内容可以概括为“人机料法环”和“检测前中后”，这些内容覆盖了PGT技术临床应用的各个环节。为使PGT技术应用更加标准与规范化，本文就PGT的质量控制进行分析和讨论，以期为高质量临床实践提供可靠的实验室诊疗依据。【关键词】植入前遗传学检测；质量控制；标准操

2、作程序胚胎植入前遗传学检测(preimplantationgenetictesting,PGT)是指对植入前的胚胎在基因或染色体水平进行遗传学检测，是一种将生殖医学与分子遗传学结合的胚胎筛选技术，选择检测范围内未见特定变异或特定变异所致遗传性状在可接受范围内的胚胎移植入宫腔，用于预防遗传异常导致的流产，以及阻断严重基因病或染色体病的传播，从而避免出现遗传性出生缺陷，最终生育子代的辅助生殖技术。根据不同的遗传类型，PGT分为植入前非整倍体检测(preimplantationgenetictestingforaneuploidy,PGT-A)、植入前单基因遗传病检测(preimplantation

3、genetictestingformonogenicdisease,PGT-M)及植入前染色体结构重排检测(preimplantationgenetictestingforstructuralrearrangement,PGT-SR)1o利用合适的分子遗传学技术对特定的基因或者染色体进行检测与分析，是精准植入的前提和基础。开展PGT的分子遗传学检测实验室需要做好全面的质量控制和管理工作，才能保证向临床提供及时、准确的检验报告。鉴于PGT自身的特殊性，不仅需要在整个检测分析过程执行质量管理和控制，还需要延伸到包括实验室环境、技术人员专业素质、仪器设备、检测试剂和耗材、实验操作流程的规范性等多个方

4、面的质量控制以确保检测结果准确可靠，具有时效性和可溯源性。本文对PGT的分子遗传学检测质量控制进行分析和讨论，旨在促进分子遗传学检测在PGT领域更加规范且有效地实施和专业化发展。一.PGT质量控制基本要素1 .人员条件：分子遗传学检测技术包括对样本检测的“湿实验”和利用生物信息学分析检测结果的“干实验”两部分，对检测结果的判读和解释有较高的要求2,因此PGT实验室需建立可满足开展检测要求的专业技术人员团队，检测人员通过能力评估后方可上岗。具体条件如下：检测人员需经省级以上卫生行政部门指定机构技术培训合格并取得“临床基因扩增检验实验室技术人员上岗培训合格证”3；获得“临床医学检验技术考试合格证书

5、具备临床检验资质的技术人员4；具有生物信息学相关专业知识的生物信息学分析人员和具备对遗传变异的解读能力、结果判读能力、分子检测专业知识的报告人员4。2 .仪器设备管理和使用：从事分子遗传学检测的医疗机构须遵守国家卫健委制定的医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则中对工作区域仪器设备配置标准的要求。为保证检测质量，实验室应常规开展仪器设备使用和管理的质量控制工作，制定标准操作程序(standardoperatingprocedure,SOP)文件用于参考和查询，主要包括仪器设备的规范化使用方法以及仪器设备的维护和校准程序等。在此基础上，实验室可独立开展检测工作，也可择优与经卫生行政部门批准的

6、高通量测序技术临床应用于胚胎植入前遗传学诊断的试点或正式运营的符合资质要求的医学检验机构开展合作检测，将检测交由对方进行4。3 .试剂、耗材的选择和使用：目前，商品化试剂盒的使用已非常广泛，实验室应优先选择使用经药品监管部门审批注册、具有医疗器械注册证的试剂和耗材。若采用实验室自制试剂，需对所有自制试剂制定SOP文件,详细规定试剂的制备过程及原材料来源等内容5-6。每批次新制试剂须与当前使用试剂进行实验比对，并对每批次实验质控品的检测结果进行认真评估7。定期(每月)对试剂耗材的质控合格率进行统计，排查失控原因并针对原因进行改进。若质控失控主要为质检人员操作不当，则进一步规范培训质检人员操作；若

7、质控失控主要为试剂耗材本身问题，联系试剂耗材厂家，订购新批次试剂耗材或更换试剂耗材供应商。4 .实验室SOP的可操作性和遵守性：SOP是具有可操作性的实验室全员遵循的程序，是实验室质量控制的基础，也是管理人员检查工作的依据。SOP源于标准文件，如仪器试剂说明书、国际国内标准文件和实验室验证流程等。遵循SOP使重复性操作具有一致性，检测全过程有章可循，实验记录有据可查，保证实验结果的可靠性、可比性和可控性6。针对不同的检测方法和平台均需制定对应的SOP,并在检测过程中严格遵照执行，不能随意改变，及时进行评估和更新。分子遗传学检测实验室SOP的主要内容应包括以下内容：知情同意告知；样本采集、运输、

8、样本接收、保存、登记和处理；检测方法和步骤(样品制备、处理和分析测试)；试剂和耗材的选择和保存，自配试剂需详细注明试剂的制备过程及原料来源；试剂性能验证和方法确认；仪器的使用、维护和校准；实验室数据、相关文件记录与保存；室间质评。5 .分子遗传学实验室环境布局(1)分子遗传学实验室区域设计原则：分子遗传学实验室应通过省级临床检验中心的技术审核，获得“临床基因扩增检验实验室技术审核验收合格证书”，按照“工作有序、互不干扰、防止污染”的原则开展检测工作。实验室应设置以下区域：样本接收与储存区、试剂储存和准备区、全基因组扩增(WhOIegenomeamplification,WGA)区、样本制备区、

9、文库构建区、文库扩增区、测序区，以上各区域在物理空间和使用中必须完全相互独立,始终处于完全分隔的状态3。(2)分子遗传学实验室的空气流向：实验室应保证空气有效流通且各区域之间的空气不能直接相通，防止核酸提取及建库扩增等过程中产生的核酸气溶胶在样本间交叉污染和被既往扩增产物污染81。分子遗传学实验室可通过安装排风扇、负压排风装置等方式实现空气流向按照WGA区一样本制备区一文库构建区一文库扩增区一测序区进行，以防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域2。(3)分子遗传学实验室的污染监测：依据PCR扩增基本原理和PCR实验室核酸污染监测经验，定期(每月)监测实验室各个区域内的紫外照射的强度、空气中气溶

10、胶污染的情况，可通过利用文库构建引物或测序引物对各区域开盖放置一段时间后的PCR管进行PCR扩增监测实验室内核酸污染情况。二 .PGT检测前、检测中、检测后的质量控制措施1 .检测前的质量控制(1)样本采集：根据不同技术体系的差异，可在PGT中采集极体、卵裂球或囊胚滋养外胚层细胞等胚胎不同发育阶段样本的细胞。目前，临床常采集囊胚期滋养外胚层细胞进行活检1,4,其过程是在远离囊胚内细胞团的位置活检35个胚胎滋养外胚层细胞，装入含有磷酸缓冲盐溶液的离心管中，并通过唯一编号与胚胎一一对应，标示清晰无破损或污染4,9o若行PGT-M或PGT-SR,则需采集夫妻双方及先证者25mL外周血，使用EDTA抗

11、凝管保存，并填写家系信息表，行相关基因检测及单体型分析以明确致病位点与多态性位点的连锁关系，避免因等位基因脱扣(alleledrop-out,ADO)造成误诊或诊断不明10T1。(2)样本运输及保存：将样本放入低温保存箱，以确保样本在28冷藏条件下冷链运输，运输时间应在2h以内，长时间转运需干冰保存。(3)样本接收及保存：样本交接时，接收人员需检查样本量和样本类型等是否符合检测要求，并核对转接表的样本信息，双人核对样本信息准确无误后交接双方签字10o收到样本后，根据各医疗机构辅助生殖诊疗流程，给样本赋予唯一编号后，将信息导入胚胎检测相关管理程序中，审核后保存样本接收记录并存档。进行样本操作前后

12、样本均应在-20环境中保存。2 .检测中的质量控制(I)DNA提取、保存的质量控制：DNA提取质量将直接影响后续文库构建和测序数据的质量。实验室需根据不同的样本类型建立对应的核酸提取操作方法的SOP,检测样本包括但不限于外周血、干血片、细胞、组织及其他体液样本等。核酸提取的质量控制标准需监控核酸浓度、总量、纯度和完整性等方面10o一般情况下，DNA纯度A260/280应在1.62.2之间，且琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA主带无降解和污染10-11。(2) WGA：目前常用的WGA技术主要包括简并寡核甘酸引物PCR(degenerateoligonucleotideprimed-PCR,DOP-

13、PCR)、多重置换扩增技术(multipledisplacementamplification,MDA)和多次退火环状循环扩增技术(multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,MALBAC)o实验室应优先选择通过医疗器械注册的成品试剂盒，没有医疗器械注册证成品试剂盒的项目，实验室可以根据已有经验选择合适的检测试剂，并建立相应的SOP12oWGA的质量控制需遵循以下原则：每次实验需设立阴性对照(洗涤液空白对照)和阳性对照(35个细胞样本)样本5。需对扩增后的DNA进行产量和片段大小的检测：PiCoPLEX(SurePlex)产量应不低

14、于1.8g,MDA不彳氐于6.9g,三LBAC不彳氐于0.7goWGA的片段可通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其大小,Picopiex(Sureplex)方法主要分布在250l000bp,MALBAC方法主要分布于5002000bp,阴性对照在100bp处有引物二聚体条带，MDA方法则主要分布在4OO(TIO000bpo实验全过程需双人核对，包括但不限于对样本信息、试剂配制、扩增程序等关键环节的核查，避免样本混淆。(3)文库构建及质量控制：文库构建是PGT中的关键步骤，文库构建的质量将直接影响检测结果。文库构建过程的质量控制包括以下两点：对于已获批的试剂盒应按试剂盒说明书进行操作，确定最低起始建

15、库的DNA投入量。对于自配试剂应测试出有效并能够满足建库需求的最低起始建库的DNA投入量10,例如：运用液相杂交捕获的方法，建议样本初始量为200ng,对于扩增子捕获实验，建议样本初始量为Iong9-10,13o对已完成构建的待测文库进行质量控制时，需要根据不同检测项目和检测平台的要求来监控文库的浓度、总量、产物片段的长度及分布、阴性及阳性对照的文库质检情况，并制定接受或拒绝的标准来判定批次文库构建是否成功10O例如，PGT-A文库QUbit检测浓度一般大于05ngL,样本体积不少于20L,具体浓度需参考不同检测平台或试剂盒的要求执行。3 .检测后的质量控制(1)测序数据质量控制：测序数据的质

16、量对检测结果的准确性非常关键。测序时应根据不同的检测样本选择适合的测序平台与方案,以保证测序数据能够满足数据质量和靶向区域覆盖度的要求。实验室需要针对不同的检测平台和检测流程统计测序指标的正常波动区间并设定质控阈值14o测序数据的关键参数包括测序深度、覆盖均一性、碱基检出质量值Q30、GC含量、比对质量值等。测序深度：理论上说，增加某一区域的测序深度在一定范围内可提高该区域位点的准确性和可信度15o例如，PGT-A要求测序深度不低于0.01X,获得的reads数不低于1M；PGT-M/SR单体型分析所用的SNP区域测序深度应满足单体型分析的要求。覆盖均一性：在对目标区域进行测序时，不同位置的测

17、序深度有所不同。序列结构如Ge含量高的区域、碱基重复区域等可能影响特定基因组区域所需的覆盖深度，导致测序深度低于阈值2。例如，PGT-A要求全基因组测序覆盖度不低于4%,其他项目覆盖度应满足数据分析的要求。碱基识别的质量值：测序平台都会给出碱基识别的错误概率，称为Phred-Iike质量值或Q值，Q30表示该碱基识别的正确率为99.9%,通常临床实验室高通量测序检测要求Q3080%2。在进行数据分析时，需将低于设定值的reads过滤去除。由于不同测序平台之间计算方法不同，其Q值不一定是完全等价的，因此，如需更换不同的测序平台，则要重新进行性能确认。GC含量：GC含量可影响测序反应的效率，进而影

18、响该区域的覆盖均一性2。GC含量应在每个批次检测中进行监测，其波动提示该批次检测性能可能存在异常。通常外显子区域GC含量（49%51%）,基因组DNA的GC含量（38%39%）,正常GC含量差异10%,应接近正态分布。测序数据的过滤：为提高数据分析的准确性，需要对原始测序的序列过滤后再进行数据分析。（2）序列比对：通过软件将数据过滤去除后保留下来的合格reads（FASTQ文件）定位至基因组相应的位置。参考序列可选择GRCh37或GRCh38,比对后最常见的文件类型为BAMSAMo不同平台的测序模式和测序读长不同，需对流程进行充分测评，以获得最佳效果，选择适合的软件14o（3）报告撰写发放及数

19、据、剩余样本保存检测报告规范：PGT的检测报告是帮助临床诊断、精准治疗、指导生育的重要依据，因此报告内容应做到全面、准确、规范12。检测报告应包括但不限于以下内容：受检者的基本信息，包括姓名、性别、年龄、患者适应证等；样本的基本信息，包括样本唯一编号、样本类型、采样日期、样本接收日期等；应注明检测项目、检测方法、检测级别及检测局限性等；检测结果、结果解释以标准的专业方式进行描述；应根据目前的资料对检测中发现的染色体拷贝数变异进行分类，包括致病性、可能致病性，临床意义不明，可能良性和良性4；检测机构信息和报告日期；检测人、报告审核签发人签字；其他相关提示与声明。检测报告的发放：PGT专业性很强，

20、且检测报告包含受检者的个人身份及数据等隐私信息，发送过程应严格遵循信息保密原则16,检测报告应首选发送给送检医师，检测结果由送检医师与患者沟通，以免受检者及家属对报告理解不当而造成不必要的心理负担17o数据与资料的保存：高通量测序通常会产生多个文件和庞大的数据。FASTQ文件和BAM文件较大，可以重新分析；VCF文件和最终的结果报告单文件较小，但不能重新分析M。美国ACMG指南建议FASTQ文件和BAM文件至少保存2年，VCF文件和实施本项技术全过程相关的原始资料，包括患者的病历资料、知情同意书、高通量测序检测申请单、原始实验数据记录、相关的电子信息文档、高通量测序检测报告单等，均需在医疗机构

21、保存30年以上14o实验室应在SOP文件中明确保存文件的类型、不同文件的保存时间。检测产生的数据和资料涉及患者的个人隐私，中华人民共和国民法典规定医疗机构及其医务人员应当对患者的隐私和个人信息保密。泄露患者的隐私和个人信息，或者未经患者同意公开其病历资料的，应当承担侵权责任。未经患者同意，检测数据不得公开。涉及国家安全的还需严格遵守中华人民共和国数据安全法。检测后样本的保存和处理：剩余的胚胎全基因组扩增产物样本应保存至产后2年以上。必要时可再次进行本项检测以进一步核实检测结果M。对临床实验室的样本、培养物的处理需符合医疗废物管理条例和医疗卫生机构医疗废物管理办法相关要求，确保生物安全。（4）定

22、期进行检测数据或结果的分析和评估及检测异常结果的原因分析：每月对DNA提取成功率、WGA扩增成功率、文库构建成功率及测序成功率进行统计，并对每次实验的阴性质控和阳性质控合格率进行统计分析，在阴性质控和阳性质控合格的情况下，对样本出现的异常检测结果进行原始数据重新分析或者重新进行文库构建测序以明确异常原因。4 .室间质评和室间比对：开展PGT的分子遗传学实验室应定期参加国家卫生健康委临床检验中心组织的室间质评项目，利用室间质评样本对实验室检测能力进行质控，若临检中心无相关室间质评项目，可以参加不同实验室间的项目比对，确保实验室检测流程的规范性和准确性12,18。目前国家卫生健康委临床检验中心已开

23、展PGT-A室间质量评价计划调查工作，不久将会正式实施。室间比对可以在不同检测实验室之间开展，相互规范和提高各自实验室的检测技术和水平，例如，PGT-A项目,实验室A将3个已知染色体非整倍体结果（含三体、单体、整倍体）的样本寄往实验室B进行检测，同时实验室B将3个已知染色体非整倍体结果（含三体、单体、整倍体）的样本寄往实验室A进行检测，检测结束后反馈检测结果给对方，A核对B的检测结果，B核对A的检测结果，根据结果比对情况分析影响结果的可能因素并进行改进和提高。三 .总结从整个质量管理过程来看，PGT的质量控制可以总结为“人机料法环，检验前中后”，不仅需要涵盖检测全过程，还包括对人员、仪器设备、检测试剂和耗材、实验方法及技术标准操作流程及实验室布局与环境监控等软硬件设施的质量管理。随着辅助生殖技术临床开展规模的日益扩大，以及分子遗传学检测技术的快速发展，对PGT实验室开展严格的质量控制工作，促进使该项技术的应用更加规范和有效，以保证胚胎检测结果的准确性和可靠性，进而保障出生子代的安全。