植物病原细菌学实验.ppt

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1、植物病原细菌学实验植物病原细菌学实验实验一植物病原细菌常用培养基实验一植物病原细菌常用培养基的制作与灭菌的制作与灭菌1.1.了解细菌培养基的种类；了解细菌培养基的种类；2.2.掌握常用细菌培养基的配方和制作方法；掌握常用细菌培养基的配方和制作方法；3.3.掌握培养基的灭菌方法掌握培养基的灭菌方法。一、实验目的一、实验目的 二、实验内容和操作方法二、实验内容和操作方法（1）配配方方：牛牛肉肉膏膏3，蛋蛋白白胨胨 10，NaCl 5，琼琼脂脂 20，蒸馏水，蒸馏水 1000 L。1.1.牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基(NA)(NA)：分离和培养最常用：分离和培养最常用（2）配配制制过过程程：

2、将将牛牛肉肉膏膏、蛋蛋白白胨胨、NaCl 溶溶于于蒸蒸馏馏水水后后，调调节节pH7.2，加加入入琼琼脂脂溶溶化化后后分分装装于于三三角角瓶瓶和和试管。试管。（一）培养基的配制（一）培养基的配制2.Hugh和和Leifson（HL）培养基：细菌的好氧性和厌）培养基：细菌的好氧性和厌氧性测定氧性测定蛋白胨蛋白胨2.0g氯化钠氯化钠5.0g磷酸氢二钾磷酸氢二钾0.2g琼脂琼脂3.0g蒸馏水蒸馏水1000.0mlpH7.47.8溴百里酚兰（溴百里酚兰（1.6酒精溶液酒精溶液1.5ml）待培养基融化，并调待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管后，装于试管中，每支试管装装9ml灭菌。培养基凝固后，

3、用接种针蘸细菌悬浮液针刺灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。分别在培养接种，一直刺到管底。分别在培养2、4和和7d后观察记后观察记录。录。好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。管的下部和闭管中生长。（1）配配 方方：NH4H2PO41.0，氯氯 化化 钾钾 0.2，MgSO4.7H2O 0.2，蒸蒸馏馏水水1000 L，溴溴百百里里酚酚兰兰（1.6%酒精溶液）酒精溶液）1.5 mL;1%碳素化

4、合物。碳素化合物。3.Ayers3.Ayers培养基：碳素化合物产酸试验培养基：碳素化合物产酸试验 单单糖糖（葡葡萄萄糖糖、半半乳乳糖糖）；双双糖糖（麦麦芽芽糖糖、乳乳糖糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。有有的的细细菌菌不不产产酸酸和和气气，有有的的只只产产酸酸不不产产气气，少少数数植植物病原细菌既产酸又产气物病原细菌既产酸又产气（3）分分装装：将将上上述述培培养养基基分分装装于于试试管管中中，每每管管10 mL左左右右。如如果果测测定定气气体体产产生生，加加上上杜杜氏氏发发酵酵小小玻玻管管后灭菌。后灭菌。产产酸酸时时培培养养液液变变黄黄，产产碱碱时时变变蓝蓝，产产

5、气气则则小小玻玻管管内内培养液被部分排出，出现空隙培养液被部分排出，出现空隙。（2）配配 制制 过过 程程：将将 NH4H2PO4、氯氯 化化 钾钾、MgSO4.7H2O溶溶于于蒸蒸馏馏水水，调调节节pH7.0后后加加入入溴溴百百里里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入）4.4.MR MR和和VPVP试验：对葡萄糖的分解能力试验：对葡萄糖的分解能力（1）配配方方：蛋蛋白白胨胨5，葡葡萄萄糖糖5，磷磷酸酸氢氢二钾二钾5，蒸馏水，蒸馏水 1000 L。（2）配配制制过过程程：将将蛋蛋白白胨胨、葡葡萄萄糖糖、磷磷酸酸氢氢二二钾钾溶溶于于蒸蒸馏馏水水

6、调调节节 pH7.0-7.2，每每管管分分装装5mL即可。即可。5.硝酸盐还原硝酸盐还原（1）配配方方：硝硝酸酸钾钾1.0，蛋蛋白白胨胨5.0，酵酵母母膏膏3.0，蒸馏水，蒸馏水1000L，pH7.0-7.2（2）配配制制过过程程：将将硝硝酸酸钾钾、蛋蛋白白胨胨、酵酵母母膏膏称好后，溶解于蒸馏水后，调节称好后，溶解于蒸馏水后，调节 pH。6.6.半胱氨酸培养液：测定产半胱氨酸培养液：测定产H H2 2S S能力能力（1）配配方方：蛋蛋白白胨胨10，硫硫酸酸钠钠0.1g，半半胱胱氨氨酸酸0.1g，蒸馏水蒸馏水1000L。（2）配配制制过过程程：将将半半胱胱氨氨酸酸、蛋蛋白白胨胨、硫硫酸酸钠称好

7、后钠称好后，溶解于水中，调节溶解于水中，调节 pH7.0-7.3即可。即可。7.吲哚试验吲哚试验（1）配配方方：蛋蛋白白胨胨20.0，磷磷酸酸氢氢二二钠钠2.0g，葡萄糖葡萄糖10.0g，蒸馏水，蒸馏水1000L。（2）配配制制过过程程：将将蛋蛋白白胨胨等等称称好好后后，溶溶解解于于蒸馏水，调节蒸馏水，调节pH7.0-7.2即可。即可。8.8.明胶液化明胶液化（1）配配方方：牛牛肉肉浸浸膏膏3.0g，蛋蛋白白胨胨5.0，明明胶胶10-12%，蒸馏水，蒸馏水1000L。（2）配配制制过过程程：将将牛牛肉肉浸浸膏膏、蛋蛋白白胨胨溶溶解解于于蒸蒸馏馏水水中中，调调节节pH7.0-7.2后后，将将明明

8、胶胶溶溶解解于于此此溶液中，即可分装于试管中。溶液中，即可分装于试管中。9.淀粉水解试验淀粉水解试验（1）配方：）配方：牛肉浸膏牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨蛋白胨17.5，淀粉淀粉1.5 g，琼脂琼脂15-20 g，蒸馏水蒸馏水1000 L。（2）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉）配制过程：将牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉称好后，溶解于蒸馏水中，加入称好的琼脂，称好后，溶解于蒸馏水中，加入称好的琼脂，待融化后调节待融化后调节pH7.0-7.2。10.10.石蕊牛乳反应石蕊牛乳反应（1）配方：脱脂牛乳1000L，石蕊液（4%）15-20mL。（2）配制过程：提前配制石蕊液（二）培养基的灭菌（二）培养基的

9、灭菌上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。行灭菌。普通培养基为普通培养基为1212030min，以保证以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆灭菌后立即摆放成斜面放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。层琼脂。明胶培养基灭菌明胶培养基灭菌12-1512-15分钟。分钟。石蕊牛乳培养基

10、间歇灭菌石蕊牛乳培养基间歇灭菌3 3次，每次通蒸汽次，每次通蒸汽20-30 20-30 分钟。分钟。灭菌方法灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。菌目的。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是基于水的沸高压蒸汽灭

11、菌用途广，效率高，是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高时，水蒸气的温度升高到到121，经，经2030min，可全部杀死锅内物品上，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等等都可应用此法灭菌。都可应用此法灭菌。操作方法和注意事项如下操作方法和注意事项如下:加水加水打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。注意水要打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。注意水要

12、加够，防止灭菌过程中干锅。加够，防止灭菌过程中干锅。装料、加盖装料、加盖灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。排气排气打开放气阀。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸打开放气阀。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持维持5min，使锅内冷空气完全排净。，使锅内冷空气完全排净。升压、保压和降压升压、保压和降压当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压

13、力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在（一般培养基和器皿灭菌控制在121，20min）后，停止加热，待压力降至接近后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气时，打开放气阀。阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。外。干热灭菌法干热灭菌法通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭通过使用干热空气杀

14、灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至箱中烘烤，即加热至160170维持维持12h。干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌此法灭菌。1 1 细细菌菌（NANA）和和真真菌菌(PDA)PDA)常常用用培培养养基基的的配配方方和和制制 作过程有何异同点？作过程有何异同点？2 2 试述高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。试述高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。三、作业三、

15、作业实验二实验二植物病原细菌的分离植物病原细菌的分离和致病性测定和致病性测定二、实验内容和操作方法二、实验内容和操作方法（1）首先要选择典型、新鲜病组织;（2）以灭菌剪将病斑剪下，略带健康组织，大小约0.51公分左右，放在灭菌载玻片中央，加无菌水1d。加上灭菌盖玻片，静置约10min左右，观察是否有云雾状自破口处涌出（一）细菌溢现象观察（一）细菌溢现象观察 （1）斑点型：如棉花角斑病。A.剪取新鲜的典型病斑，约1cm见方。（二）植物病原细菌的分离（二）植物病原细菌的分离1.细菌悬浮液的配制（不同症状类型分离材料的选择和表面消毒）B.表面消毒：将切取的组织块在70乙醇中浸一下立即取出，然后用表面

16、消毒剂进行表面消毒，可以采用0.1升汞，152min或0.5的次亚氯酸盐如漂白粉（1：9稀释液）2minC.消毒后用灭菌水洗涤3次，将病组织放在另一个培养皿的灭菌水中，剪破中心或以灭菌玻璃棒研碎病组织静置2030分钟，等细菌游出。（2）萎蔫型如茄青枯病将茎部剪成12寸长，表面用70酒精轻拭，在火焰上表面消毒，以灭菌刀纵剖，选择轻微变色病部，以灭菌刀切出薄片或以解剖针挑出病健交界处组织（可以不再消毒），加灭菌水浸泡20-30分钟。如果茎部较粗，也可以在表面消毒后用解剖刀横断茎部，用夹子或手紧压茎部横断面，挤出溢脓或汁液。（3 3）肿瘤组织）肿瘤组织 软瘤比较容易分离；木质瘤可以磨碎后接种在向日葵

17、番茄等幼株上长出瘤后再分离。由于细菌位于表皮细胞和木质部之间，因此应用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在灭菌皿中实行解剖后以灭菌玻棒将其捣碎，静置浸泡24h。（4）腐烂组织较简单，选择近病部交界处以接种环挑取少量腐烂组织，稀释。（5）种子带菌的分离选择病种子，以0.1升汞液表面消毒12min，灭菌水洗涤，再将此种子在70酒精中浸几分钟，洗涤23次，取出放在研钵中磨碎，离心取上清液。2.分离方法A.倒平板：注意培养基的温度不能太高，否则冷凝水太多，细菌在水中游动而影响单个分散菌落的形成。（1）平板划线分离法：被普遍采用B.用接种环蘸取上述配制好的菌悬液，在已凝固的平板培养基表面划线 如果

18、菌液浓度大，培养皿转动角度减小，增加划线的次数划4条线后，将接种环灭菌，培养皿转动90，从第2条线开始划45条线（2）培养皿稀释分离法0原液原液1取取1环菌液环菌液0.5L灭菌水灭菌水2混匀后取混匀后取1环环3混匀后取混匀后取1环环4混匀后取混匀后取1环环5混匀后取混匀后取1环环3.培养一般放置在 2830温箱中倒置培养，时间23 d。将冷却至45左右的培养基倒入装有稀释菌液的培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液和培养基混匀，待其凝固后培养。4.细菌的纯化 挑取分离出的典型单菌落平板划线培养（2皿），如此重复12次，最后，在均匀一致的平板中，挑取典型菌落移植在斜面培养基上培养，长成后在4环境中保存

19、菌种。1.配制107-108CFU/mL的细菌悬浮液，菌龄48小时左右；（二）致病性测定（二）致病性测定 2.指示植物的选择：一般用烟草，在假单胞和黄单胞菌属上较适用。3.接种方法：用注射器将细菌液从烟草下表皮注入叶肉细胞间。用灭菌水作阴性对照，同属HR阳性的菌株作阳性对照。4.培养条件：接种后的植物应保持在25，相对湿度较高（85%）的条件下。5.结果观察：在2448h表现枯斑为阳性反应，3d左右出现黄斑为阴性反应。三三 作业：作业：1.简述本实验中植物病原细菌的分离步骤及其操作注意事项2.烟草过敏性反应试验能够确定细菌的致病性吗？为什么？实验三植物病原细菌的形态观察实验三植物病原细菌的形态

20、观察1.了解革兰氏染色鉴定的快速鉴定方法；2.掌握革兰氏染色和鞭毛染色的方法；3.掌握细菌培养性状的描述特征。一、实验目的一、实验目的 二、实验内容和操作方法二、实验内容和操作方法 1.结晶紫草酸铵染色（一）革兰氏染色（一）革兰氏染色 （1）试剂A.结晶紫草酸铵染剂：溶液：结晶紫2.0g，酒精（95%）20mL混合溶液和，过滤，贮藏于试剂瓶中，24h后使用。溶液：草酸铵0.8g，蒸馏水80mLC.复染剂原液：番红O2.5g，95%酒精100mL复染剂：原液10mL，蒸馏水90mLB.鲁戈尔碘液：碘1.0g，碘化钾2g蒸馏水300mL。将碘和碘化钾在研钵中研和，慢慢加水并继续研和直至碘和碘化钾溶

21、解，然后加水稀释到300mL，盛入棕色试剂瓶，放暗处备用。（2）染色程序A.配制细菌悬浮液：菌龄16hB.在干净的载玻片上涂片、风干，不要加热，然后在火焰上通过2次，固定玻片。C.结晶紫染色1分钟，水洗数秒钟，吸干。D.碘液处理1分钟，水洗，吸干。E.用95%酒精褪色约30秒。水洗，吸干F.番红O复染10秒，水洗，吸干G.加1滴香柏油，在油镜下镜检，红色为革兰氏阴性菌，紫色为革兰氏阳性菌。2.氢氧化钾溶解试验（1）试剂：3氢氧化钾（2）方法：取12滴3氢氧化钾溶液置于干净的玻片上，用牙签取新鲜细菌培养物与氢氧化钾混合，充分搅拌1020秒，如果液滴变粘稠并可拉出丝状物体，表示测试菌为革兰氏阴性菌

22、反之则为革兰氏阳性菌。1.试剂（二）鞭毛染色（西萨基尔法）（二）鞭毛染色（西萨基尔法）（1）媒染剂：单宁酸10g，ALCL3.6H2O18g，ZnCL210g，碱性品红1.5g，60%酒精40mL在研钵中加入酒精和上述各种成分，充分研磨后，再加入其余的酒精。使用前用蒸馏水稀释2倍，染色时过滤，滤液直接滴在涂片上。溶液：碱性品红0.3g，酒精（95%）10mL溶液和分别配制后混合。溶液：苯酚（结晶）5g，蒸馏水95mL（2）染液：2.染色步骤（1）载玻片准备：选用新的或没有伤痕的，先用洗洁精浸泡洗涤，用清水洗净后，再放入酸酒精（硫酸与酒精等量混合）中浸泡24-48h，取出后用清水洗净，再用蒸馏

23、水洗，沥干水后，浸泡在95%酒精中备用。（2）配制细菌悬浮液，菌龄很重要，一般适温培养16-24h。用吸管沿试管壁缓缓加入无菌水5mL，静置30分钟左右，配成菌悬液。（3）涂片：取浸在酒精中的载玻片，在火焰上烧去酒精，平放，用吸管吸取细菌悬浮液（以上层为好）在载玻片的一端滴一滴，然后将载玻片稍稍倾斜，使菌悬液从一端缓缓流向另一端，使涂片自然风干。（4）媒染剂过滤后，直接将滤液滴在涂片上，处理5-7分钟（5）用水轻轻洗去染媒剂，甩去载玻片上剩余的水，在空气中干燥后，再加苯酚品红染剂染色5分钟。（6）水洗，在空气中干燥后，加1滴香柏油，在油镜下观察鞭毛的数量和着生位置。1.革兰氏染色反应和鞭毛染色

24、在植物病原细菌鉴定中有何作用？为什么？2.细菌鞭毛染色对菌龄的要求比较严格，在操作过程中也要注意动作的轻柔，为什么？3 观察和记录NA平板上的细菌菌落性状、菌体形状、运动性和革兰氏染色结果。三三 作业作业实验四实验四植物病原细菌生理生化测定植物病原细菌生理生化测定1.掌握无菌操作技术；2.了解各种生理生化性状测定常用试剂的配制方法；3.掌握各种生理生化性状的观察方法。一、实验目的一、实验目的 二、实验内容和方法二、实验内容和方法 1.产酸和产气试验（一）碳素化合物的利用（一）碳素化合物的利用1）接菌培养：一般每5 mL培养液接种0.1mL 108CFU/ml菌悬液，适温下培养3-4周。2）结果

25、观察：产酸：培养液变为黄色产碱：培养液变为蓝色CK：培养液为草绿色变色产气：杜氏发酵小玻管出现空隙CK：杜氏发酵小玻管不出现空隙产气（1）配 方：NH4H2PO41.0，氯 化 钾 0.2，MgSO4.7H2O0.2，蒸馏水1000L，溴百里酚兰（1.6%酒精溶液）1.5mL;1%碳素化合物。AyersAyers培养基：碳素化合物产酸试验培养基：碳素化合物产酸试验 单单糖糖（葡葡萄萄糖糖、半半乳乳糖糖）；双双糖糖（麦麦芽芽糖糖、乳乳糖糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。有有的的细细菌菌不不产产酸酸和和气气，有有的的只只产产酸酸不不产产气气，少少数数植植物病原细菌既产酸

26、又产气物病原细菌既产酸又产气（3）分装：将上述培养基分装于试管中，每管10mL左右。测定气体产生时，加上杜氏发酵小玻管后灭菌。（2）配 制 过 程：将 NH4H2PO4、氯 化 钾、MgSO4.7H2O溶于蒸馏水，调调节节pH7.0后后加入溴百里酚兰，最后加入碳素化合物（也可分别灭菌后加入）3）MR试验结果观察：取上述培养液5ml，加甲基红试剂23滴，呈明显红色为阳性，呈黄色为阴性。2.甲基红(MR)和VP(产3-羟基丁酮)试验1）接菌培养：一般每5mL培养液接种0.1mL108CFU菌悬液，适温下培养1周。2）甲基红试剂配制：甲基红0.1g溶解于300ml的95%酒精中，然后用蒸馏水稀释至5

27、00ml。4）VP试验结果观察：每毫升加0.1mL40%KOH溶液,置48-50水浴处理2h，充分摇动后观察结果。在4h内出现红色者为阳性反应。测定亚硝酸，每试管加试剂A和试剂B各1ml如呈红色，表示有亚硝酸根。1）接菌：在培养液中接菌后培养1周（二）氮素化合物的分解（二）氮素化合物的分解2）Griess-Llosvary试剂测定法 试 剂 A：对 氨 基 苯 磺 酸 8.0g，5mol/L醋 酸（286.0ml冰醋酸加715.0ml水）1000ml 试剂B：二甲基-萘胺6ml，5mol/L醋酸1000ml1.硝酸盐还原1）醋酸铅滤纸条的制备：将滤纸剪成5mm50mm的小条浸在5%醋酸铅溶液中

28、空气中干燥后，在120烘箱中灭菌1h。2）接菌：将细菌接种于试管中的培养液中后，用上述制备的滤纸条夹在棉花塞和试管壁之间，使纸条悬在培养液面上，但不要碰到培养液，25培养2周。3）结结果果观观察察：纸纸条条变变黑黑表表示示有有硫硫化化氢氢产产生生，为为阳阳性性反应。反应。2.硫化氢产生1）草酸滤纸条的制备：将滤纸剪成5mm50mm的小条浸在饱和草酸溶液中，空气中干燥后，在120烘箱中灭菌1h。2）接菌：将细菌接种于试管中的培养液中后，用上述制备的滤纸条夹在棉花塞和试管壁之间，使纸条悬在培养液面上，但不要碰到培养液，适温培养1周。3）结果观察：纸纸条条变变淡淡红红色色表表示示有有吲吲哚哚产产生

29、生，为为阳阳性反应。性反应。3.吲哚产生1）接菌：采用穿刺法接菌后，放在适温中培养1-3周。以不接菌试管为对照。（三）大分子化合物的利用（三）大分子化合物的利用2）结果观察：将将经经过过培培养养的的接接菌菌试试管管取取出出后后，放放在在4冰冰箱箱中中，看看其其是是否否凝凝固固，如如不不凝凝固固，则则说说明明明明胶胶分解而导致液化，为阳性反应。分解而导致液化，为阳性反应。1.明胶液化A.酸的产生：石蕊牛乳变成粉红色，表示从乳糖产酸1）接菌：将培养基接种细菌于28培养1-3周，以不接种的石蕊牛乳做对照。2）结果观察：2.石蕊牛乳反应B.凝固：产酸达到pH4.7发生凝块，如产气凝块断裂；凝乳酶的作用

30、而凝固，凝块收缩与乳清分离。C.胨化：牛乳变清，往往从表层开始D.碱的产生：石蕊牛乳变蓝色，胨化时常呈碱性E.石蕊还原：石蕊变为无色在在平平板板上上加加碘碘液液后后，培培养养基基为为深深兰兰色色，菌菌落落周周围围有无色透明圈者为阳性。有无色透明圈者为阳性。1）接菌：将细菌接种于淀粉琼脂平板上，适温下培养24-48小时。2）结果观察：3.淀粉水解试验四、细菌的好氧性和厌氧性测定四、细菌的好氧性和厌氧性测定蛋白胨蛋白胨2.0g氯化钠氯化钠5.0g磷酸氢二钾磷酸氢二钾0.2g琼脂琼脂3.0g蒸馏水蒸馏水1000.0mlpH7.47.8溴百里酚兰（溴百里酚兰（1.6酒精溶液酒精溶液1.5ml）待培养基

31、融化，并调待培养基融化，并调pH后，装于试管中，每支试管后，装于试管中，每支试管装装9ml灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺灭菌。培养基凝固后，用接种针蘸细菌悬浮液针刺接种，一直刺到管底。接种，一直刺到管底。分别在培养分别在培养2、4和和7d后观察记后观察记录。录。好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，好氧性细菌，只在开管的上部生长；兼性厌氧性细菌，则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开则在开管的上下部都能生长；厌氧性细菌，则只能在开管的下部和闭管中生长。管的下部和闭管中生长。1）试剂：1%二甲基对苯二胺盐酸盐或1%四甲基对苯二胺盐酸盐。（五）其他生理生化试验（五

32、其他生理生化试验2）测定方法：1.氧化酶试验A.Kovacs：在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3-4滴试剂使其湿润，用牙签挑取24h菌苔涂在滤纸上，60秒内变成紫色为阳性反应，秒内变成紫色为阳性反应，60秒后或不便色为阴性。秒后或不便色为阴性。B.滤纸条法：用滤纸条蘸少许菌苔，加1d试剂，立即呈粉红色为阳性1）试剂：3%过氧化氢2）测定方法：挑取固体培养基上培养24-48h的菌苔，置于干净玻片上，滴加过氧化氢。2.过氧化氢酶（接触酶）试验3）结果观察：在在半半分分钟钟内内有有大大量量气气泡泡产产生生的的为为阳阳性性，不产生气泡的为阴性。不产生气泡的为阴性。三三 作业：作业：1若有吲哚和硫化氢产

33、生，其实验的试管口上的滤纸条会发生什么样的颜色变化，为什么？2在石蕊牛乳不能和其他细菌培养基一起灭菌，为什么？反应中会出现多种不同的反应，试分析其发生的原因？3观察和记录细菌氧化发酵试验、MR试验以及接触酶试验结果。实验五实验五植物病原细菌的植物病原细菌的PCR分子鉴定分子鉴定 1了解PCR反应的原理；2掌握PCR反应的操作方法。一、实验目的一、实验目的 二、二、PCR扩增扩增聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称，简称PCR）1、PCR技术的基本原理技术的基本原理类似于类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与目标序列的天然复制过程，其特异性依

34、赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。两端互补的寡核苷酸引物。PCR由由变性变性-退火退火-延伸延伸三个反应步骤构成：三个反应步骤构成：模板模板DNA的变性的变性：模板：模板DNA经加热至经加热至94左右一定时间左右一定时间后，使模板后，使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，解离，使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）；使之成为单链（以便它与引物结合，为下轮反应作准备）；模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单经加热变性成单链后，温度降至链后，温度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序

35、列单链的互补序列配对结合；配对结合；引物的延伸引物的延伸：DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互链互补的半保留复制链，重复循环补的半保留复制链，重复循环变性变性-退火退火-延伸延伸三过程，三过程，就可获得更多的就可获得更多的“半保留复制链半保留复制链”，而且这种新链又可成，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，分钟，23小时就

36、能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2 The procedure of PCR5533d.NTPsTaqPrimers5353535353535353componentdenaturation535353535353(94)extension53535353353TaqTaq55repeatedanneal(72)(50)53535353553353532cycles4copies3cycles8copies5353535353535353535353355353535310反应缓冲液（含反应缓冲液（含Mg2）5.0 ldNTP混合物，混合物，10 mm

37、ol/L1.0 l上游引物，上游引物，20 mol/L1.0 l下游引物，下游引物，20 mol/L1.0 l模板模板DNA1.0 lTaq plus DNA聚合酶，聚合酶，5 U/l0.5 l加双蒸水至终体积为加双蒸水至终体积为50 l 3 反应体系反应体系 取一取一0.5 ml PCR薄壁管，依次加入以下试剂：薄壁管，依次加入以下试剂：M 1 2 3 43kb2kb0.8%agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160M:DNA marker;1:Y160;2:positive control;3 4:CK-2

38、7kb引物量：引物量：每条引物的浓度每条引物的浓度0.11umol或或10100pmol，以以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度：酶及其浓度：目前有两种目前有两种TaqDNA聚合酶供应，聚合酶供应，一种是一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U(指总反应指总反应

39、体积为体积为100ul时时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。则合成产物量减少。4 PCR反应操作注意事项：反应操作注意事项：dNTP的质量与浓度的质量与浓度dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，扩增效率有密切关系，dNTP粉粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或或1MTris。HCL的缓冲液将其的缓冲液将其PH调节到调节到7.07.5，小量分装，小量分装，-20冰冻冰冻

40、保存。多次冻融会使保存。多次冻融会使dNTP降解。在降解。在PCR反应中，反应中，dNTP应为应为50200umol/L，尤其是注意尤其是注意4种种dNTP的浓度要相等的浓度要相等(等摩尔等摩尔配制配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。产物的产量。dNTP能与能与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度降低。模板模板(靶基因靶基因)核酸核酸模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与成败与否的关键环节之一。否的关

41、键环节之一。Mg2+浓度浓度Mg2+对对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的在一般的PCR反应中，各种反应中，各种dNTP浓度为浓度为200umol/L时，时，Mg2+浓度为浓度为1.52.0mmol/L为宜。为宜。Mg2+浓度过高，反应特浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合聚合酶的活性，使反应产物减少。酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择反应条件的选择PCR反应条件为反应条件为温度、时间和循环次数温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：温度与时间的设置：基于基于PC

42、R原理三步骤而设置变性原理三步骤而设置变性-退退火火-延伸三个温度点。延伸三个温度点。变性温度与时间：变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原失败的最主要原因。一般情况下，因。一般情况下，9394lmin足以使模板足以使模板DNA变性，变性，若低于若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产产物完全变性，就会导致物完全变性，就会导致PCR失败。失败。退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：重要因素。

43、重要因素。变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060，可使引物，可使引物和模板发生结合。由于模板和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。浓度，还有靶基序列的长度。延伸温度与时间：延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度之间，常用温度为为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。，过高

44、的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般般1Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min是足够是足够 的。的。34kb的靶序列需的靶序列需34min；扩增；扩增10Kb需延伸至需延伸至15min。延。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数循环次数决定循环次数决定PCR扩增程度。扩增程度。PCR循环次数主要取决循环次数主要取决于模板于模板DNA的浓度。一般的循

45、环次数选在的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。5PCR污染与对策污染与对策PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生造成假阳性的产生.1）污染原因）污染原因标本间交叉污染标本间交叉污染PCR试剂的污染试剂的污染PCR扩增产物污染扩增产物污染.实验室中克隆质粒的污染实验室中克隆质粒的污染2）污染的监测）污染的监测对照试验对照试验阳性对照阳

46、性对照阴性对照阴性对照重复性试验重复性试验选择不同区域的引物进行选择不同区域的引物进行PCR扩增扩增3）防止污染的方法）防止污染的方法合理分隔实验室合理分隔实验室样枪样枪预混和分装预混和分装PCR试剂试剂防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用一次性使用.设立适当的阳性对照和阴性对照设立适当的阳性对照和阴性对照减少减少PCR循环次数循环次数选择质量好的选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩应先离心，将管壁及

47、管盖上的液体甩至管底部至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出开管动作要轻，以防管内液体溅出.1、PCR反应反应：A.取0.5ml 的eppendorf 管中依次加入效率试剂（共50l）:35l H20 5l 10X PCR反应缓冲液 4l 25 mmol/L MgCl2 4l 4种 dNTP 0.5l 上游引物（引物1）0.5l 下游引物（引物2）0.5l 模板DNA(约1ng)0.5ul Taq DNA聚合酶（约2.5单位）混匀后离心5秒钟二、实验内容和操作方法二、实验内容和操作方法 B混合物在94下加热5min。C94 变性30秒种，62退火1分钟，72延伸2分 钟，循环30轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于 72下保温10分钟，使反应产物扩增充分。2、电泳：、电泳：取10 ul扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。三、作业三、作业1简述PCR反应基本原理及其操作注意事项